罗 虎，李永恒,孙振江,梁坤国,许旺发,赖铭雪

(广西中粮生物质能源有限公司，广西 北海 536100)

燃料乙醇作为一种可再生的清洁能源，受到世界各国的青睐[1]。随着世界燃料乙醇产业的快速发展，玉米等粮食的消耗量大大增加，燃料乙醇产业与人畜争粮的矛盾日益突出，因此，粮食作物原料的有限供给制约了燃料乙醇产业的进一步发展，发展“非粮”木薯燃料乙醇已成为世界燃料乙醇技术的发展趋势[2-3]。传统的燃料乙醇发酵工业是能耗较高的产业，蒸煮工段能耗约占整个乙醇生产总能耗的30%，因此，从节约蒸煮工段的能耗来说，生料发酵作为一种边糖化边发酵的乙醇生产新工艺，正受到世界各国的关注[4-6]。

同传统木薯发酵酒精技术相比，生料发酵乙醇工业的最大优点体现在下面几个方面[7]。首先，在熟料发酵工艺中，液化工序消耗蒸汽占整个发酵过程中蒸汽消耗的30%。而生料发酵无需对原料蒸煮和冷却，这样可以节约能耗以及相关设备的购置和维护费用，可以大大降低生产成本[8-9]。其次，在传统工艺中，高温蒸煮会导致一些可发酵性糖的损失和非发酵性杂质的产生，造成淀粉利用率低[10]。而生料发酵工艺不会带来这些问题，且发酵过程中渗透压较低，有利于酵母生长。因此，生料发酵的酒精度较高，可以高达18%以上，淀粉利用率也很高。最后，在传统蒸煮工艺中，料液黏度较高，限制发酵醪浓度的提升。由于无需蒸煮，生料发酵液中物料黏度小，料液输送性能良好，有利于实现高浓度发酵。同时，由于发酵液黏度小，换热效果好，乙醇蒸馏过程可节省大量的蒸汽和冷却水[11]。

最近几年来，对木薯生料发酵生产燃料乙醇的研究取得了一定进展。首先，马文超[12]和沈晖等[13]分别对玉米和木薯生料发酵制备乙醇的工艺条件进行了研究，此后，黄加军等[14]验证了高效生淀粉酶对发酵的促进作用。最近，申乃坤等[15]则对木薯生料发酵生产高浓度燃料乙醇的工艺进行研究，为其工业化生产奠定了基础。

高效生淀粉酶的出现使液化效果可以达到发酵工艺要求，但受到混合不均、反应效率下降的影响，淀粉酶的添加量比喷射工艺的用量有所增加。然而，对高效设备的投资及新型酶制剂的使用并不一定会带来效益和增值。有些工艺在拌料过程中加热至糊化点以下的温度，调节pH，加入酶制剂搅拌混合进行一段时间的预液糖化，再降温进入发酵[16]；而其他工艺在发酵温度下拌料后直接进行同步酶水解(糖化)和发酵过程，两种工艺都可以达到较高的酒精度和酒精转化率，哪种工艺更具优势需要进一步研究比较。生料发酵工艺往往与浓醪发酵联系在一起，大多数研究中，配料干物浓度都在 30%以上。对浓醪生料发酵干物浓度与淀粉出酒率关系的研究发现，生料工艺随着拌料干物浓度的提高(最高达33%)，发酵醪液的淀粉出酒率不断提高，这意味着粮单耗的降低，但残总糖和残淀粉的含量也逐步提升[17]。

本文中，笔者拟利用正交试验法对木薯生料发酵生产燃料乙醇的工艺进行优化研究，确定最佳的工艺优化条件，以期为进一步工业化生产提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

木薯粉，广西中粮生物质能源有限公司；尿素(总氮≥46.4%)，湖南宜化化工有限责任公司；生料淀粉酶，诺维信公司；糖化酶，杰能科有限公司；酵母，安琪有限公司；浓H2SO4、NaOH，市售分析纯。

1.2 仪器设备

U3000型高效液相色谱仪，美国戴安公司；CX21-310型数码生物显微镜，奥林巴斯株式会社；BIOF6050B/3型50 L三联中试发酵罐，上海高机生物工程有限公司；SKY-110X型往返式水浴恒温振荡器，上海苏坤实业有限公司；S40型精密型台式pH/电导率测量仪，梅特勒-托利多有限公司；HWY-2102型双层大容量恒温摇床，上海智诚有限公司；MF-50型水分测定仪：日本AND公司。

1.3 试验方法

木薯生料发酵生产燃料乙醇工艺见图1。

图1 工艺流程Fig.1 Diagram of fuel ethanol production with cassava raw materials

除去木薯原料中石块、铁块、编织物等杂质后，通过粉碎机破坏木薯的组织结构，使淀粉充分释放。粉碎后的木薯粉配制成一定浓度的粉浆，同时添加漂白粉和酶试剂，输送至发酵罐进行浸泡处理。此后，向浸泡好的粉浆中添加扩培好的酵母(水常温活化1 h)以及青霉素和营养盐等，进行同步糖化发酵。发酵后的成熟醪经蒸馏和分子筛脱水后，获得燃料乙醇成品。具体实验方法如下。

1.3.1 调浆水温影响实验

按料水比为1∶ 2.0配料，添加1.0×10-5mol/L的杀菌剂和15 U/g的淀粉酶，经过不同温度(35～55 ℃)浸泡2 h后，降温至33 ℃，并加入0.15%(质量分数)的干酵母、1.0×10-5mol/L的杀菌剂和0.20%(质量分数)的尿素，发酵温度维持33 ℃，发酵120 h。

1.3.2 料水比影响实验

按不同料水比(1∶ 3～1∶ 1.8)配料，浸泡温度50 ℃，其他条件同1.3.1节。

1.3.3 不同干酵母添加量影响实验

按料水比为1∶ 2.0配料，酵母添加量为0.05%～0.25%(质量分数)，其他条件同1.3.2节。

1.3.4 发酵温度影响实验

酵母添加量为0.10%(质量分数)，发酵温度28～42 ℃，其他条件同1.3.3节。

1.3.5 发酵周期影响实验

发酵温度34 ℃，其他条件同1.3.4节，分析不同发酵周期(40～140 h)对发酵的影响。

1.3.6 节氮源影响实验

发酵周期120 h，其他条件同1.3.5节，分析不同氮源添加量对发酵的影响。

1.4 检测方法

残糖含量测定按照斐林试剂法[18]进行。

外观糖度、酒精度、挥发酸和酸度等按照酒精厂常规分析测定方法[19]。残淀粉和残糊精计算见式(1)和(2)。

残淀粉含量=ρ(残总糖)-ρ(过滤总糖)×0.9

(1)

残糊精含量=ρ(过滤总糖)-ρ(还原糖)×0.9

(2)

2 结果与讨论

2.1 粉浆浸泡对发酵的影响

图2 调浆水温对发酵的影响Fig.2 Effects of water temperature on the fermentation results

为了解决生料发酵过程中发酵初始酵母没有可直接利用的碳源问题，通过不同调浆水温(35～55 ℃)对淀粉进行浸泡酶解，使初始发酵液中存在一部分酵母可利用的糖，然后在33 ℃发酵条件下生料酶继续将淀粉进行酶解，持续释放出小分子糖，结果见图2。由图2可知：提高调浆水温有利于提高出酒率，降低残总糖含量，可提高原料的利用率，但是木薯淀粉的糊化温度为60～70 ℃，过高的水温不仅增加能耗，且会导致粉浆糊化，不利于物料的输送。木薯淀粉经温水调浆后保温浸泡一段时间，可使淀粉颗粒吸水膨胀，有利于下一步酶的液化水解，从而提高出酒率，缩短发酵时间。因此，调浆水温控制在55 ℃为宜。

2.2 料水比对发酵的影响

料水比是发酵时加入的原料与水用量的比值，它对发酵结果有重要的影响。高浓度的生料发酵，加水量少，粉浆浓度高，后期产生的废水也相对减少，但是粉浆浓度高，黏度相对也大，传质传热差，不利于物料的传热和酶解。同时，高底物浓度引起渗透压升高，对酶和酵母产生一定的抑制作用。因此，考察料水比对发酵的影响，1 t木薯加酶2 kg,结果见图3。

图3 料水比对发酵的影响Fig.3 Effects of material to water ratio on the fermentation results

由图3可知：随着料水比的降低，发酵得到的酒精度逐渐降低，发酵醪液黏度也随之降低。这可能是由于乙醇发酵属于厌氧发酵，当加水量较多时，厌氧条件较好，而发酵醪浓度太稀降低了酶的浓度，导致发酵不充分，酒精度降低。同时料水比太高，黏度增大，影响物料输送，物料传质传热效果差，最佳的料水比应该是黏度越低，发酵酒精度越高。综合发酵酒精度和实际生产中的经济效益，最佳的料水比为1∶ 1.86(即粉浆质量分数为30.1%)。

2.3 活性干酵母接种量对发酵的影响

酵母生长合成自身所需要的营养成分会消耗掉一部分糖，造成糖分的损失，发酵酒分下降。接种量过多会造成原料的浪费，并增加生产成本，而接种量过少会延长发酵周期，设备利用率低。因此，考察发酵初始活性干酵母的接种量对发酵的影响，结果见表1。

表1 接种量对发酵的影响

由表1看出:随着活性干酵母用量的增加，发酵酒精度和还原糖、残总糖含量变化波动较大，但是不同处理方式间相差不明显。当接种量为0.10%(质量分数)时，发酵得到的酒精度较高，且还原糖和残糖量比较低。因此，接种0.10%的活性干酵母对发酵比较合适。

2.4 温度对发酵的影响

发酵过程中，温度不但会影响酵母的生长代谢，而且会影响酶的催化活性。因此，考察发酵温度对发酵结果的影响，结果见图4。

图4 温度对发酵的影响Fig.4 Effects of temperature on the fermentation results

由图4可知：发酵温度为28～36 ℃时，温度对发酵得到的酒精度影响不大；但温度>36 ℃时，发酵液中的残总糖增高，酒精度也随之降低，表明高温抑制了酵母的生长，代谢活力降低，发酵速度减慢。因此，该酵母菌株的发酵温度为32～36 ℃。

2.5 发酵周期的影响

酒精发酵是典型的产物抑制，在酒精度达到4%左右时，就开始产生抑制，发酵速度逐渐降低，当酒精度达到一定数值后，再继续延长发酵时间已没有太大意义。因此，考察发酵周期对发酵结果的影响，结果见表2。

表2 发酵周期影响实验

从表2可以看出：随着发酵时间的延长，酒精度逐渐增高，还原糖和残总糖量逐渐降低。综合考虑设备的利用率情况，可以选120 h为适宜发酵时间。

2.6 氮源对发酵的影响

氮源是构成菌体物质和一些代谢产物的必需营养物质，是酵母细胞合成代谢的重要原料。因此，需要通过实验，了解生料发酵过程中氮源对酵母的影响。实验结果表明，发酵24 h时，添加尿素的醪液样品中酵母数最大，并进入发酵高峰期，比空白对照样增加了2倍左右(数据未显示)。这个结果说明在发酵过程中，添加适量的氮源，可以促进酵母的生长。

进一步考察尿素增加量对发酵的影响，结果见图5。

图5 不同尿素添加量对发酵的影响Fig.5 Effects of urea dosage on the fermentation results

由图5可知：尿素添加量在0.20%时，酒精度，发酵结束后发酵得到的酒精度越高、残总糖含量越低。尿素添加量小于0.20%(质量分数)时，发酵得到的酒精度较低、残总糖较高，表明氮源添加量不足，酵母生长与代谢受到影响。而当尿素添加量高于0.25%时，对发酵效果的影响不明显(图5)。综合成本因素，尿素添加量以0.20%～0.25%为宜。

2.7 正交试验设计及结果

为了进一步确定木薯粉生料发酵酒精的最佳条件，以发酵酒精度为指标，选择料水比、温度、氮源、接种量和发酵周期5个因素进行四水平正交试验，试验设计及结果见表3，误差分析见表4。

表3 L16(45)正交试验设计及结果

表4 误差分析

由表4可知：木薯粉生料发酵酒精的最优水平组合是A2B2C1D3E3，即料水比1∶ 2.0、温度32 ℃、氮源2.0 g/L、接种量0.15%、发酵周期120 h；根据极差R值，影响因子主次顺序依次为E、A、B、C、D，即发酵时间、料水比、温度、氮源、接种量。

进一步对表3正交试验得到的结果进行方差分析，结果见表5。

由表5可知：料水比、发酵周期对木薯粉发酵酒精影响显著，其余4个因素的影响不显著。

表5 方差分析

因此，在正交试验得到的最佳条件下进行发酵试验来验证，具体结果见表6。

表6 最佳条件下的发酵酒精度

由表6可知：在最佳条件A2B2C1D3E3下进行3次验证试验，试验的发酵酒精度平均为15.12%，淀粉利用率91.33%，并且3次试验的结果较稳定，说明该工艺组合效果好、可靠，适合木薯粉生料发酵酒精。

3 结论

通过单因素影响实验，初步确定了木薯生料发酵条件为：调浆水温为50～55 ℃、料水比为1∶ 2.0，活性干酵母接种量为0.10%(质量分数)，发酵温度32～34 ℃，发酵周期120 h，尿素添加量为0.20%～0.25%(质量分数)。

通过正交试验分析主要的影响因素，影响因子主次顺序依次：发酵时间、料水比、温度、氮源、接种量。并进一步确定了最佳条件：料水比1∶ 2.0，活性干酵母接种量0.15%(质量分数)，发酵温度32 ℃，发酵周期120 h，尿素添加量0.20%(质量分数)。该条件下发酵得到的酒精度可到达15.12%(体积分数)，淀粉利用率91.33%。