张立军　李芸　张艳霞　杨志军　马骏　戴海蓉

摘要：目的 比较高乌头不同溶剂萃取部分的急性毒性大小，筛选高乌头的毒性部位，为阐明高乌头的毒性成分提供依据。方法 采用系统溶剂法对高乌头95%乙醇提取物进行萃取，依次得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水提6个不同的溶剂萃取部分，通过半数致死量（LD50）和最大给药量法对高乌头不同溶劑萃取部分的急性毒性进行比较研究。结果 高乌头三氯甲烷、水提及正丁醇部分LD50分别为89.65、1805.40、24 409.41 mg/kg，95%可信区间分别为76.39～108.41、1521.60～2240.00、20 422.54～24 246.95；高乌头石油醚、乙酸乙酯及乙醇部分最大给药量分别为2686.01、3108.13、28 376.21 mg/kg。结论 高乌头三氯甲烷部分毒性最大，乙醇部分毒性最小。

关键词：高乌头；不同溶剂萃取部分；急性毒性；半数致死量；最大给药量；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）03-0053-05

Abstract： Objective To compare the toxicity of different extraction parts of Aconitum sinomontanum Nakai； To screen out “toxic sections” of Aconitum sinomontanum Nakai； To provide references for further study on toxicity components of Aconitum sinomontanum Nakai. Methods Systematic solvent method was used to extract the 95% ethanol extracts of Aconitum sinomontanum Nakai， and six different extraction fractions （petroleum ether， chloroform， ethyl acetate， butanol， alcohol and water） were obtained. Median lethal dose （LD50） and maximum dose method were used to conduct comparative study on acute toxicity of different extraction parts of Aconitum sinomontanum Nakai. Results Chloroform， water and butanol extractions in LD50 of Aconitum sinomontanum Nakai were 89.65， 1805.40 and 24 409.41 mg/kg， and 95% confidence limits were 76.39～108.41， 1521.60～2240.00 and 20 422.54～24 246.95， respectively. The maximum dose of petroleum ether， ethyl acetate and alcohol extractions were 2686.01， 3108.13 and 28 376.21 mg/kg， respectively. Conclusion The maximum toxicity is the extracted section of chloroform， and the minimal toxicity is the extracted section of ethanol.

Keywords： Aconitum sinomontanum Nakai； different extraction parts； acute toxicity； LD50； maximum dose；mice

高乌头为毛茛科乌头属植物高乌头Aconitum sinomontanum Nakai的根，又名麻布七、辫子七、破骨七等，是我国中西部地区民间习用中药，也是著名“七药”之一，具有祛风除湿、理气止痛、活血散瘀的功效，用于治疗风湿痹痛、关节肿痛、跌打劳伤等，现收载于2009年版《甘肃省中药材标准》[1]。现代药理研究表明，高乌头具有镇痛、抗炎、解热、局麻等广泛的药理作用[2-3]，临床上常用于治疗风湿性关节炎及局部镇痛[4-5]，高乌头中主要活性成分为二萜生物碱，其中以高乌甲素和冉乌头碱含量最高[6-7]，而活性成分之一高乌甲素已开发出不同剂型应用于临床[8]，也有不良反应案例报道[9]，其原因是高乌头毒性较强[10]，而其毒性机制尚不清楚，使其临床应用受限。本实验先用系统溶剂法得到高乌头不同溶剂萃取部分，为进一步明确高乌头的毒性部位，再用急性毒性试验方法对高乌头不同溶剂萃取部分进行比较，筛选出毒性部位，为阐明高乌头的毒性成分提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠240只，雌雄各半，鼠龄6～8周，体质量18～22 g，甘肃中医药大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（甘）2011-0001。饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验室，温度23～26 ℃，相对湿度50%～60%，自由摄食饮水。

1.2 药物及制备

高乌头药材，购自甘肃省天祝藏族自治县农贸市场，经甘肃中医药大学药学院杨扶德教授鉴定为高乌头的干燥根。取高乌头药材，净制，润软，切片（厚约5 mm），自然干燥，筛去碎屑，用10倍量95%乙醇冷浸超声2次，每次冷浸24 h，超声45 min，过滤，合并2次滤液，回收乙醇，所得稠膏加水制成混悬液，依次用石油醚、三氯甲烷、水饱和乙酸乙酯、水饱和正丁醇分别萃取（每种溶剂均200 mL×4），得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分，剩下为乙醇部分。将乙醇提取后的药渣挥尽乙醇，加10倍量水浸泡1 h，回流提取1 h，抽滤；残渣再加8倍量水，回流提取1 h，抽滤，合并2次滤液，浓缩，得到水提部分。回收溶剂时，除水、乙醇和正丁醇部分减压浓缩温度低于85 ℃，其他部分减压浓缩温度均低于35 ℃。将各萃取部分进行冷冻干燥，备用。

1.3 主要试剂与仪器

石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲基纤维素等均为分析纯，95%乙醇、二甲苯、石蜡、苏木精，伊红（天津市百世化工有限公司）。KQ3200DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BT 125D电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），奥林巴斯显微镜（日立，型号OLYMPUS BX60），LGJ-18S型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）。

1.4 预实验

取上述高乌头各溶剂萃取部分适量，分别置于研钵中，用0.5%甲基纤维素溶解配制最大浓度药液（以灌胃针能吸取和推动为准），给药前禁食不禁水16 h，按体质量给予小鼠灌胃给药1次，找出最小100%死亡量（Dm）和最大0%不死量（Dn），进行半数致死量（LD50）测定[11]，若无法测定LD50值，则按照《药物单次给药毒性研究技术指导原则》[12]的要求，测定最大给药量值。

1.5 正式实验

1.5.1 高乌头三氯甲烷、正丁醇及水提部分的半数致死量测定

选用小鼠160只，雌雄各半，随机分为三氯甲烷部分、水提部分、正丁醇部分各5个组和空白对照组。给药前禁食不禁水16 h，三氯甲烷、正丁醇、水提部分各组分别按照20 mL/kg给予对应受试药液灌胃，空白对照组给予给等体积0.5%甲基纤维素溶液灌胃[11]。观察给药后14 d内小鼠各种反应，并记录死亡时间、死亡只数及体质量变化，同时将死亡小鼠及时解剖，肉眼观察各主要脏器有无明显病理改变，10%甲醛溶液保存。

1.5.2 高乌头石油醚、乙酸乙酯及乙醇萃取部分最大给药量测定

选用小鼠80只，雌雄各半，随机分为石油醚部分组、乙酸乙酯部分组、乙醇部分组和空白对照组。给药前禁食不禁水16 h，各组均按照最大浓度（以灌胃针能吸取和推动为准）和最大体积（40 mL/kg）灌胃1次[12]。给药后连续观察14 d，记录各组小鼠毒性反应及死亡情况，并计算小鼠最大给药量倍数。该剂量相当于临床日给药量的倍数。

小鼠最大给药量倍数=（小鼠日最大给药量/ g）/（小鼠平均体质量/20 g）×（成人平均体质量（60 kg））/（成人日用量/9 g）

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。毒理学数据统計采用Bliss法[13]，同时计算LD50及95%可信区间。

2 结果

2.1 预实验结果

经预实验得到高乌头三氯甲烷、正丁醇及水提部分的Dm分别为192.83、3987.60、29 266.00 mg/kg，Dn分别为37.31、946.30、15 277.03 mg/kg；而石油醚、乙酸乙酯及乙醇部分于1 d内给予0.4 mL×1、0.8 mL×1、0.8 mL×2，均不引起小鼠死亡，故不进行LD50测定，进行最大给药量测定。

2.2 高乌头三氯甲烷、正丁醇及水提部分半数致死量

高乌头不同溶剂萃取部分对小鼠急性毒性强度差异较大，依次为三氯甲烷部分、水提部分、正丁醇部分，LD50分别为89.65、1805.40、24 409.41 mg/kg。结果见表1。

2.3 高乌头石油醚、乙酸乙酯及乙醇部分最大给药量

石油醚、乙酸乙酯、乙醇部分，分别按相应最大浓度（0.067 2、0.077 7、0.709 4 g/mL）和最大给药体积（均为40 mL/kg）灌胃给药1次，连续观察14 d，未见动物死亡，小鼠大小便及颜色、毛色、眼、鼻、口腔分泌物均未见异常。结果最大给药量分别为2686.01、3108.13、28 376.21 mg/kg，分别相当于497.407、3453.333、697.199 g原药材/kg（相当于60 kg成人临床用量的3316、23 022、4648倍）。

2.4 小鼠死亡潜伏时间、中毒症状、体质量变化及尸检情况

三氯甲烷部分：神经系统表现为给药后1～3 min活动减少，4～5 min站立不稳、抽搐、狂躁，7～8 min强直性抽搐，角弓反张，翻身，遗尿；心血管系统表现为体热，雄鼠睾丸肿胀，心律不齐；呼吸系统表现为喘息，面、足部紫绀；消化系统表现为7～8 min腹部严重扭曲。一般7～18 min内死亡，个别35 min死亡，且给剂量越大，死亡潜伏期越短，中毒症状越明显。未死亡小鼠先安静后兴奋、爬笼，腹部微抽，约30 min后恢复自主活动。对死亡小鼠解剖肉眼观察可见大多出现肝脏瘀血、肺瘀血、胃肠胀气、腹腔有轻微出血。存活小鼠于14 d后脱颈处死解剖，各脏器肉眼观察未见明显异常。

正丁醇部分：类似上述中毒症状，但较轻，死亡潜伏期明显不同。一般15～30 min死亡，少数90 min以上死亡。对死亡小鼠解剖肉眼观察结果与三氯甲烷部分相似。存活小鼠于14 d后脱颈处死解剖，各脏器肉眼观察未见明显异常。

水提部分：类似上述中毒症状，但轻微，一般在8～20 min内死亡，个别24 min死亡。对死亡小鼠解剖肉眼观察结果与三氯甲烷部分相似。存活小鼠14 d后脱颈处死解剖，各脏器肉眼观察未见明显异常。

石油醚部分：开始安静，腹部微抽，平趴，乏力，站立不稳，50 min后逐渐恢复正常。14 d后脱颈处死解剖，各脏器肉眼观察未见明显异常。

乙酸乙酯部分：开始安静，偶见喉中鸣响，30 min后逐渐恢复自主活动。14 d后脱颈椎处死解剖，各脏器肉眼观察未见明显异常。

乙醇部分：给药后先静止，呼吸急促，干呕，腹部抽搐，6 h后逐渐恢复自主活动，进食饮水。14 d后脱颈处死解剖，各脏器肉眼观察未见明显异常。

各部分均显示给药剂量越大，死亡潜伏期越短，中毒症状越明显；存活小鼠体质量与空白对照组比较无明显差异。见表2。

2.5 高乌头三氯甲烷部分对小鼠主要脏器的影响

急性毒性实验结果显示，高乌头三氯甲烷部分毒性最强（LD50最小），故选择该组死亡小鼠主要脏器进行HE染色观察。病理观察显示，与空白对照组比较，高乌头三氯甲烷部分组小鼠心、肝、肺、肾和脑的组织结构与细胞形态均有一定改变。心脏部位细胞核增大；肝脏部位出现轻-中度脂肪变性、肝血窦扩张和肝瘀血；肺部位出现肺泡壁增宽、增厚和代偿性肺气肿；肾脏部位出现肾小球体积增大，肾间质有出血和毛细管充血、瘀血；脑部位出现胞浆个别细胞嗜酸性增强、体积变小。见图1。

3 讨论

观察高乌头6个溶剂萃取部分的中毒反应发现，共同中毒症状为活动减少、狂躁、呼吸抑制、抽搐，角弓反张而死亡。所不同的是，水提部分能明显观察到呕吐现象，面、眼和腹部紫绀，眼球明显外凸，遗尿。这些中毒症状说明受试物中毒的靶器官主要是中枢神经系统、呼吸系统和心血管系统，与病理结果相符。文献研究显示，高乌头中高乌甲素具镇痛和局麻作用[14]，造成小鼠活动减少和呼吸抑制很可能与高乌甲素有关，这与其他中药毒性研究一致，毒性成分也是其有效成分。水提部分毒性反应不同于其他部分，推测其含有的毒性成分可能与其他萃取部分不同。

在高乌头正丁醇部分急性毒性实验中发现，由于受给药浓度和体积的限制，始终找不到实验动物100%死亡的剂量。共经过4次预实验，结果均显示，动物死亡数量不随给药剂量的增大而增加，当给药剂量增大到一定程度，达到最大给药量（能够配制的最大浓度和最大给药体积）时，死亡率最大达到60%。因此，在计算LD50时，数据中无动物100%死亡率，原因可能是高乌头毒性成分极性偏小，主要集中在三氯甲烷部位。

高乌头具有很强的镇痛抗炎活性，其含有的高乌甲素成分被列为我国首创的非成瘾性镇痛药，被广泛应用于临床，具有较好的市场应用前景。同时高乌头也有一定的毒性，历代本草著作均记载“高乌头辛、苦、温，有毒”，使其临床应用受限。本实验通过系统溶剂法和急性毒性试验对高乌头进行研究，发现高乌头不同溶剂萃取部分急性毒性差异很大，其中三氯甲烷部分毒性最大，乙醇部分毒性最小。有研究显示，高乌头中含有生物碱、黄酮、甾体等化学成分，其中以二萜生物碱为主，而此类生物碱主要集中在三氯甲烷部分[6，15]。对高乌头毒性贡献的物质基础可能与多种化学成分有关，具体与化学成分之間关系还需要后续进一步分析研究，以期更好地应用于临床。

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（收稿日期：2017-03-15）

（修回日期：2017-03-27；编辑：华强）