喻玺 李素媛 刘恒

摘 要：该研究比较了氧化铝柱、分子印迹柱和凝胶色谱3种前处理方法，用于反相高效液相色谱荧光法测定食用油中苯并芘的含量，以保留时间定性、外标法定量。结果表明，在1～20ng/mL线性范围内，线性相关系数为0.999773，方法检出限为0.1μg/kg，氧化铝柱法平均回收率为119.0%，相对标准偏差为3.6%；分子印迹柱法平均回收率为90.0%，相对标准偏差为5.0%；凝胶渗透色谱法平均回收率为100.0%，相对标准偏差为2.1%。同时用3种方法对质控样测试，经比较，凝胶渗透色谱法重现性、灵敏度高于另外2种方法，适用于食用油中苯并芘的测定。

关键词：反相高效液相色谱；苯并芘；凝胶渗透色谱；油

中图分类号 TS225.11 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）03-04-0076-3

Abstract： Compared the alumina column，molecularly imprinted column and gel permeation chromatography（GPC） three pretreatment methods，by using reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC） with fluorescence detection to determine the benzo（a）pyrene content in edible oil，using retention time for qualitative analysis and external standards for quantitative analysis.The results showed that in the linear range of 1～20ng/mL，the linear correlation coefficient was 0.999773，the method detection limit was 0.1μg/kg，the average recovery rate of alumina column was 119.0%，and the relative standard deviation （RSD） was 3.6%.The average recovery rate of molecularly imprinted column method was 90.0%，and the relative standard deviation （RSD） was 5.0%.The mean recovery of gel chromatography was 100.0% and the relative standard deviation （RSD） was 2.1%.At the same time，three methods were used to test the quality control samples.After comparison，gel chromatographic method was more reproducible and more sensitive than the other two methods，which were applicable to the determination of benzopyrene in edible oil.

Key words： Reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC）；Benzo（a）pyrene；Gel permeation chromatography（GPC）；Oil

苯并（a）芘[1]是由一個苯环和一个芘分子结合而成的一种五苯环芳烃化合物，具有很强的致癌性[2-5]。生产生活中燃料不完全燃烧产生的废气，食品熏制、烘烤和煎炸过程中都会产生苯并芘[6-8]，严重危害着人们的健康。我国强制性标准《GB 5009.27-2016食品安全国家标准 食品中苯并（a）芘的测定》规定了谷物及其制品、肉及肉制品、水产动物及其制品、油脂及其制品中苯并（a）芘的检测，不同的食品用不同的预处理和提取方法，标准提供的前处理方法主要有中性氧化铝柱和分子印迹柱2种净化方式。然而空气中水分、阳光的照射、不同品牌甚至不同批次对氧化铝活性皆有影响[9]；不同品牌的分子印迹柱质量也存在差异。故而，当这2种净化方法得出的结果存在差异时，需要一种更可靠的方法来保证最终结论的准确性。凝胶渗透色谱[10-12]（GPC）是目前应用比较广泛的一种前处理方法，能有效去除油脂、多糖、高聚物、蛋白质等高分子基质的干扰，且凝胶渗透色谱系统密闭，可有效避免试剂挥发，在保证样品高效分离的同时，又能保护操作人员的身体健康和实验室安全[13-15]。将GPC用于食用油中苯并芘检测的前处理，是一种新型、准确、快捷的手段，本文将3种方法比较，结果较为满意。根据《GB 2716-2005食用植物油卫生标准》规定的最大限量值为10μg/kg，当实际检测结果在限量值附近时，国标上规定的2种方法若出现不一致的结论，用GPC可以更方便检验人员作出更准确的判定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 食用植物油，苯并芘标品（纯度99.5%），苯并芘食用油质控样（中国检验检疫科学研究院测试中心），乙腈（色谱纯）、环己烷（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯），水为去离子高纯水。氧化铝固相萃取柱（ProElut BaP 22g/60mL，迪马科技），分子印迹柱（BAP-3，成都雅源科技有限公司），色谱柱（C18，5μm，4.6mm×250mm，Waters），GPC-全自动定量浓缩仪（LC-Tech Freestyle），高效液相色谱仪（Waters e2695）

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件 流动相为乙腈+水（88+12，v/v），流速1.0mL/min，激发波长384nm，发射波长406nm，进样量为10μL，柱温35℃。

1.2.2 标准溶液的配制 称取苯并（a）芘标品1mg（精确至0.01mg）于10mL容量瓶中，用甲苯溶解定容，此母液浓度为100μg/mL。用此母液逐级稀释，配制标准系列1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL。

1.2.3 氧化铝柱前处理方式 称取试样1.0g（精确至0.001g）于50mL离心管，加入20mL正己烷，涡旋混合1min，超声5min，离心3min，重复一次合并提取液。减压蒸馏提取蒸干，用5mL正己烷溶解，待净化。氧化铝柱用30mL正己烷活化，上样，用70mL正己烷淋洗，收集所有流出液，涡旋蒸干，加入1mL乙腈定容，用过0.22μm有机滤膜，待上机。

1.2.4 分子印迹柱前处理方式 称取试样0.5g（精确至0.001g），取3mL正己烷稀释，固相萃取柱用5mL二氯甲烷，5mL正己烷活化，上样，用10mL正己烷淋洗，再用5mL二氯甲烷洗脱，收集解吸液用氮气吹干，加入1mL乙腈定容，过0.22μm有机滤膜，待上机。

1.2.5 GPC前处理方式 准确称取油样2g（精确至0.001g），用流动相（环己烷∶乙酸乙酯=1∶1，v/v）定容至10mL，混合均匀后转移至GPC进样瓶中，上样（GPC净化条件∶进样量：5mL，流速：5mL/min，循环冷却水：4.0℃，弃去前32min组分，接收14min，冲洗色谱柱5min），浓缩至2mL，准确移取1mL至进样瓶。取出进样瓶用氮气吹干，准确加入1mL乙腈溶解，涡旋1min，过0.22μm有机滤膜，待上机。

2 结果与分析

2.1 线性关系及检出限 按照优化的条件将苯并芘的标准系列浓度进样，确定保留时间为26min，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制工作曲线。在1～20ng/mL线性范围内，苯并芘的线性回归方程为y=9.49e+005x+1.82e+006，线性相关系数r2为0.999773。连续进样，不断稀释浓度，得到方法检出限为0.1μg/kg。

2.2 3种前处理方法精密度实验 向不含苯并芘的植物油中添加苯并芘标样10ng，用上述3种方法分别检测并进行6平行实验，检测值、平均值、回收率及RSD结果见表1。由表1可知，当添加量为10ng时，3种方法的RSD皆在5%以内，说明3种方法都比较可靠，符合实验要求，其中GPC的RSD%比另2种方法小，说明GPC方法的系统误差更小，精密度更高，可以作为一种新的验证方法。

2.3 实际样品的检测 用上述3种方法对质控样品进行測试分析，检测结果与实际参考值进行比较，相对标准偏差在0.7%～5.4%，GPC测得值与参考值更接近，进一步说明GPC方法具有较高的可靠性，精密度，符合检验要求，可以作为一种验证方法。

3 结论

食用油样品基质背景复杂，干扰检测结果的判定，最新的国标GB 5009.27-2016提供了氧化铝柱和分子印迹柱2种前处理方式，但是当样品中的苯并芘含量在限量值附近时，可能碰见不一致的结论，GPC可以作为一种新的佐证方法，可以提高工作效率，也可以提高分析的准确度和精密度，为检测机构检测结果填报，方法验证提供新的思路。

参考文献

[1]王广峰.苯并芘对人体的危害和食品中苯并芘的来源及防控[J].菏泽学院学报，2014，36（2）：66-70.

[2]史巧巧，席俊，陆启玉.食品中苯并芘的研究进展[J].食品工业科技，2014，35（5）：379-381.

[3]AL Juhasz，R Naidu.Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons：a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene[J].International Biodeterioration & Biodegradation，2000，45（1）：57-88.

[4]王浩，刘艳琴，杨红梅，等.高效液相色谱法测定粮食中苯并芘残留的研究[J].粮油食品科技，2007，15（1）：53-54.

[5]宋怡城.植物油中苯并芘检测及产生机理研究[J].农产品加工：下，2015，5：11-13.

[6]S Kira，T Katsuse，Y Nogami，et al.Measurement of Benzo（a）pyrene in Sea Water and in Mussels in the Seto Inland Sea，Japan[J].Bulletin of Environmental Contamination & Toxicology，2000，65（5）：631-637.

[7]朱小玲.烹饪过程中多环芳烃的产生及控制[J].四川旅游学院学报，2012，5：22-25.

[8]续颖，刘雪莹，伍蓥，等.固相萃取-液相色谱法测定食用植物油中苯并（α）芘含量[J].安徽农学通报，2017，23（6）：163-164.

[9]刘艳琴，王浩，杨红梅，等.凝胶渗透色谱-高效液相色谱法测定植物油中苯并芘[J].食品科技，2013，38（1）：327-329.

[10]黎远冬，刘宗河，涂文升，等.花生油中苯并（a）芘的高效液相色谱测定[J].广西预防医学，1997，1：29-31.

[11]傅英文，花锦，王静慧，等.凝胶色谱净化-超高效液相色谱法测定食用油中苯并芘残留[J].农产品加工，2013，5（10）：63-65.

[12]郭岚，谢明勇，鄢爱平，等.GPC-GC-MS对食用植物油中多种类型农药残留的同步测定[J].分析测试学报，2009，28（1）：67-71.

[13]万红丽，周光宏，徐幸莲，等.肉制品中3，4-苯并（a）芘的残留与检测[J].食品工业科技，2007，28（2）：251-253.

[14]李伟红，戴廷灿，周瑶敏，等.高效液相色谱法测定熟肉制品中的苯并（α）芘[J].江西农业学报，2008，20（1）：86-88.

[15]郑睿行，祝华明，龚鸿萍，等.凝胶渗透色谱-高效液相色谱联用测定食用植物油中苯并（a）芘[J].食品科学，2011，32（22），209-212.

（责编：张宏民）