支力强，杨一欣，许毛，姚舒馨，马建兵*

(1.西安市红会医院关节外科，陕西 西安 710054；2.陕西中医药大学医学科研实验中心，陕西 咸阳 712046；3.西安交通大学第一附属医院转化医学中心，陕西 西安 710061)

骨质疏松症(osteoporosis)是一种以骨量减少和骨组织微结构破坏为特征，并能导致骨脆性增加和易于骨折的全身性疾病。骨量减少的本质原因是成骨细胞与破骨细胞之间的平衡被打破，因此成骨细胞增殖和分化对骨正常结构的维持起着重要作用[1]。

沉默信息调节因子1(Sirtuin 1，SIRT1)基因是sirtuins家族研究最为广泛的一员，参与了神经退变性疾病、糖尿病、肿瘤、炎症、衰老等疾病的病理过程[2-3]。有文献报道，在成骨条件性敲除SIRT1对小鼠长骨的发育有很大影响，如骨矿物密度(bone densitometry，BMD)降低、长骨长度变短、皮质骨厚度减少、钙结节较少等[4]；并且SIRT1作为骨量的调节因子，能够抑制硬骨素的形成[5]。同时，SIRT1基因敲除也能加速骨关节炎小鼠的病程，其可能机制与细胞自噬相关基因如ATG 5、ATG 7相关[6-8].磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/ 蛋白激酶B(protein kinaseB，AKT)通路在神经细胞增殖和分化、氧化应激、细胞损伤过程中发挥了重要作用[9-11]，但SIRT1对大鼠来源成骨细胞分化的影响是否通过PI3K/AKT通路发挥效应的机制尚未清楚。

本研究通过采用SIRT1特异性激动剂白藜芦醇和抑制剂EX-527，观察其对大鼠来源成骨细胞分化能力的影响，同时测定PI3K/AKT通路磷酸化水平，以探讨SIRT1对大鼠来源成骨细胞分化能力的影响与PI3K/AKT通路的关系，为临床治疗骨质疏松症提供一个新的思路或者新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 Sprague Dawley大鼠乳鼠，购自西安交通大学实验动物中心。胶原酶A、 alizarin red S(美国Sigma公司)，白藜芦醇和EX-527(美国selleckchemicals公司)，0.25%含EDTA胰酶(美国Thermo scientific公司)，4%多聚甲醛(西安赫特生物)，羊抗兔SIRT1、Runx2、OPN、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗均购自美国Abcam公司(稀释比例均为1：1 000)，组织裂解蛋白提取液RIPA和BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)，兔SP检测试剂盒(中杉金桥有限公司)，酶标仪DENLEY DRAGON Wellscan MK 3(美国Thermo scientific公司)，Western blot发光成像系统(美国UVP公司)。

1.2 原代细胞提取 取出生1周内的乳鼠，泡在75%酒精溶液中消毒30 min，待乳鼠死亡后剪掉头颅泡在高压灭菌后的PBS溶液中，其余步骤在超净台中操作。扒开头皮剪掉颅骨，泡在另一个放PBS的皿中，剪碎颅骨，第一次消化，0.25%含EDTA胰酶消化15 min，弃掉上清液，加胶原酶A消化30 min，消化期间每4 min中震荡一次，弃掉消化液，再次加入胶原酶A消化2 h，待消化完毕后加入含血清培养基终止消化，1 000 r离心8 min，弃掉上清液，用培养液(10%胎牛血清，α-MEM培养基，1%青霉素-链霉素)重悬细胞，放入5% CO2、37℃培养箱培养，24 h后换液，即得大鼠来源原代成骨细胞。第3代细胞用于铺板，加入成骨分化液(10%胎牛血清，α-MEM培养基，1%青霉素-链霉素，10 mMβ磷酸甘油钠，50 μM抗环血酸)[12]。将细胞随机分为四组：对照组、低剂量组(10 μM)、中剂量组(20 μM)和高剂量组(40 μM)，每2～3 d换液。

1.3 CCK-8测定细胞毒性 将生长状态良好的原代细胞，以8×103/孔密度种植于96孔板中，按照CCK-8试剂盒步骤进行细胞毒性试验，用酶标仪测定450 nm处吸光度值。

1.4 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色和Alizarin red S染色 将接种于24孔板的细胞倒掉培养液，用PBS洗5 min，共洗3次，4%多聚甲醛室温固定20～30 min，再用PBS洗5 min，共洗3次，分别按BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒说明书加入ALP染色剂和1%茜素红染料，ALP室温避光孵育30 min，Alizarin red S室温孵育30 min，PBS洗5 min，共洗3次，拍照，观察颜色变化。

1.5 免疫组织化学法检测 Ⅰ型胶原量制备细胞爬片，弃去培养基，PBS冲洗3次，加入体积分数为70%的乙醇，固定30 min，根据免疫组化试剂盒要求染色，在显微镜下观察，拍照。

1.6 Western blot检测 相关蛋白表达在6孔板中加入蛋白裂解液RIPA，放置冰上裂解30 min，用细胞刮充分刮落细胞，吸取液体至EP管，经4℃ 11 400 r(12 000 g)离心10 min后吸取上清液至新EP管，进行蛋白定量。按100 μg蛋白进行上样，采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳跑胶，转移到PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入SIRT1、Runx2、OPN、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT的一抗(1︰1 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜，带辣根过氧化物酶标记二抗(1︰4 000)室温孵育2 h，再用TBST洗膜，采用强化学发光法进行定量(ChemiDoc-It 415 Imager化学发光仪，美国upland公司)，最后应用Image J软件进行定量分析。

2 结 果

2.1 细胞形态及细胞毒性 提取的原代大鼠成骨细胞24 h后换液，在显微镜下观察，可见细胞排列整齐，大小基本一致，细胞透光性好，呈长条状分布，以上说明细胞生长状况良好，可以开展后续实验。在加入低、中、高剂量非瑟酮后，经过CCK-8细胞毒性检测，发现各组间细胞在450 nm处吸光度值没有明显差异(P>0.05，见图1)，说明白藜芦醇和EX-527对细胞几无毒性，可以用于后续实验。

图1 白藜芦醇对原代成骨细胞的毒性

2.2 成骨细胞分化，ALP水平和钙结节表达 在成骨细胞经过诱导分化7、12 d后，分别检测采用BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒和alizarin red S进行ALP水平和钙结节表达(见图2a)。在加入了白藜芦醇后，ALP染色颜色变深，这说明ALP水平有明显上升，EX-527加入以后，染色颜色变浅，表明其水平呈现一个下降趋势，同样地，钙结节的形成通过Alizarin red S染色也能观察到与ALP水平同样地变化，白藜芦醇增加了钙结节的沉积，EX-527组里钙结节的沉积相比白藜芦醇组显著降低。通过ALP和alizarin red S结果表明，白藜芦醇能够促进成骨细胞的分化，抑制SIRT1后该效果同样也被抑制。

2.3 白藜芦醇对成骨分化影响 为进一步观察白藜芦醇对成骨细胞分化的影响，我们通过免疫组织化学的手段检测了Ⅰ型胶原的表达，在光学显微镜下所拍照片可以看出，白藜芦醇能够明显上调Ⅰ型胶原，其染色颜色较深，在加入EX-527后，Ⅰ型胶原的表达显著下降(见图2b)。同时，通过western blot检测了SIRT1和成骨分化相关蛋白的表达水平，如RUNX2、OPN，我们发现，白藜芦醇能特异性激活SIRT1(P<0.01)，EX-527特异性抑制SIRT1的表达(P<0.001)。伴随着SIRT1的上调与下调，成骨分化相关蛋白RUNX2和OPN也呈现了相同的表达趋势(P<0.001)，随着白藜芦醇的加入呈上升趋势，EX-527加入后明显下降，如图3所示。结果表明，激活SIRT1能够促进成骨细胞分化相关因子Ⅰ型胶原、RUNX2和OPN的表达，成骨细胞分化能力增强，抑制SIRT1后，相关因子表达下降，成骨细胞分化能力减弱。

2.4 SIRT1与PI3K/AKT通路的关系 为了进一步探究SIRT1在成骨分化中是否通过PI3K/AKT通路发挥效应，我们通过western blot技术检测了PI3K/AKT总蛋白水平与磷酸化蛋白水平。研究发现，在激活了SIRT1后，PI3K/AKT磷酸化水平显著升高(P<0.001)，然而，在抑制了SIRT1的活性以后，PI3K/AKT磷酸化水平明显下降(P<0.001或P<0.05)，见图4。结果表明，在SIRT1调控成骨分化过程中，PI3K/AKT通路在其中发挥了重要作用。

3 讨 论

骨质疏松即骨质疏松症，是多种原因引起的一组代谢性骨病变，主要特点是单位体积内骨组织量减少。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致，以骨骼疼痛、易于骨折为特征。成骨细胞和破骨细胞之间的平衡对维持骨量必不可少[12]。本研究通过探讨SIRT1对大鼠原代成骨细胞分化的影响，以寻求SIRT1在抗衰老性疾病中可能的作用机制。

本研究发现，在白藜芦醇刺激下，成骨细胞表现出ALP活性和钙结节的增加，说明白藜芦醇促进成骨细胞向成熟骨细胞分化，有利于骨量增加，这与之前的研究不谋而合[13-14]。

a 碱性磷酸酶和茜素红染色 b 免疫组化图

a western blot检测SIRT1、RUNX2、OPN的表达 b SIRT1灰度值分析 c RUNX2灰度值分析 d OPN灰度值分析注：*与对照组比较，P<0.01；**与对照组比较，P<0.001；#与Res组比较，P<0.001

a western blot检测PI3K、AKT总蛋白及磷酸化水平 b 磷酸化PI3K灰度值分析 c 磷酸化AKT灰度值分析注：**与对照组比较，P<0.001；#与Res组比较，P<0.001；##与Res组比较，P<0.05

在加入SIRT1特异性抑制剂之后，ALP活性和钙结节程度都出现明显下降，说明SIRT1在成骨分化中发挥了重要作用。我们通过检测成骨相关因子如Ⅰ型胶原、RUNX2、OPN等相关蛋白的表达，同样也发现了SIRT1能够促进成骨细胞的分化，抑制SIRT1的活性后，成骨分化也一定程度被抑制，这也从另一角度佐证了我们的猜想，SIRT1在成骨分化过程中起到重要作用。

PI3K-AKT信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖分化的关键作用，它与人类多种疾病如急性淋巴白血病、肾癌、酒精肝等的发生发展有着密切的联系[15-17]。由于PI3K-AKT信号通路与各种疾病病理生理过程相关，因此我们认为在成骨分化过程中，PI3K-AKT信号通路也扮演了很重要的角色。本研究通过加入SIRT1特异性抑制剂，研究SIRT1与PI3K-AKT通路之间的相关性，来明确PI3K-AKT通路在成骨细胞分化中发挥的作用。研究发现，在加入白藜芦醇组的成骨细胞中，PI3K-Akt的磷酸化水平明显上升，该效应在加入EX-527后被部分抵消，因此我们推测，SIRT1与PI3K-AKT通路在大鼠原代成骨细胞分化中有着不可替代的作用，PI3K-AKT信号通路可能被用于临床治疗骨量减少为特征病症的一个新的靶点。

本研究着重于SIRT1基因在成骨分化中与PI3K-AKT通路之间的关系，希望能够找到骨质疏松相关疾病发病机制，为临床治疗提供新的靶点和新的思路。

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