沈加兵，季宇腾，周婷婷，曹茂盛，陈颖，曹茂红，柯开富

(1.南通大学医学院，南通226001；2.南通大学附属医院神经内科)

·基础研究·

程序性细胞死亡蛋白4在大鼠脑出血后血肿周围域的表达及作用

沈加兵1，季宇腾2，周婷婷2，曹茂盛2，陈颖2，曹茂红2，柯开富2

(1.南通大学医学院，南通226001；2.南通大学附属医院神经内科)

[摘要]目的探索程序性细胞死亡蛋白4(PDCD4)在脑出血(ICH)后血肿周围域的表达、作用及机制，为ICH疾病的后期康复治疗提供分子靶点。方法Western blot、免疫组织化学检测蛋白质的表达变化；免疫荧光技术检测蛋白质的空间定位情况；siRNA转染进行细胞内蛋白质的干预。结果PDCD4在大鼠ICH后血肿周围组织中表达上调，最高点位于ICH后第2天；上调的PDCD4主要与神经元NeuN存在共定位，并且与上调的凋亡蛋白活化Caspase-3之间也存在共定位；体外ICH模型中(即hemin诱导的神经元凋亡模型)，通过siRNA靶向干预PDCD4的表达，则活化caspase-3明显降低，而存活因子p-Akt上调。结论ICH后血肿周围域PDCD4的表达上调与神经元的凋亡相关，并且是通过p-Akt通路发挥作用的。

[关键词]脑出血；血肿；程序性细胞死亡蛋白4；疾病模型，动物

脑出血(ICH)是中枢神经系统的急、重症，具有极高的致死率和致残率，给社会、家庭带来了沉重的痛苦和负担[1]。ICH的病理损伤主要表现为血肿周围区域神经元的损伤，以及胶质细胞的增生、活化[2]。由于中枢神经系统神经元的死亡不可再生，因此探索ICH后血肿周围区域神经元损伤的分子机制，对ICH疾病的治疗具有极大的意义。

程序性细胞死亡蛋白4(PDCD4)，顾名思义为凋亡过程中上调的基因，广泛分布于各类组织器官中。文献报道PDCD4主要影响蛋白质的转录和翻译，从而对基因表达进行调控[3]。研究证明PDCD4在癌组织中表达缺如或低表达，对癌细胞的侵袭、扩散具有促进作用，因此它又称之为抑癌基因。目前已发现PDCD4在多种类型原发性肿瘤中低表达，如肺癌、肝癌、乳腺癌以及脑肿瘤等[4]。2016年，Zhen报道PDCD4 mRNA水平在非小细胞肺癌中下调，通过体外诱导PDCD4的表达能够明显抑制肿瘤细胞的生长、增殖和细胞周期的转换，原理上是通过灭活PI3K/Akt信号通路实现的[5]。近年来，越来越多的研究揭示PDCD4不仅对肿瘤的发生发展起调节作用，它与细胞转型、炎症、凋亡、增殖以及自噬等方面关系也很密切。例如，在小鼠模型中，PDCD4的缺失能够抑制脂多糖(LPS)诱导的致死性炎性反应[6]；抑制高脂饮食诱导的肝脂质性损害[7]。此外，在糖尿病模型中，PDCD4的高表达能够诱导胰岛B细胞的凋亡[8]。也有学者们认为PDCD4的功能表达主要是维持增殖、分化和凋亡三者之间的动态平衡[9]。然而，PDCD4在ICH疾病中具有怎样的作用，目前还不得而知。因此，本研究将主要探索PDCD4在大鼠ICH模型中的表达、作用以及潜在的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(江苏省实验动物质量合格证书编号：201701835)，240～260 g，SPF级，由南通大学实验动物中心提供。所有实验动物的护理及外科手术均遵照1996年颁布的国家研究委员会的伦理要求操作。

1.2 实验分组 主要分成2组。假手术组：只插针未注射；ICH组：颅内注射自体血50 μL。

ICH模型取3、6、12 h，1、2、3、5、7d为时间点，每组各12只大鼠，共96只；假手术组12只大鼠，总计108只大鼠。

1.3 ICH模型 以复合麻醉剂(3 mL/kg)腹腔注射麻醉；大鼠脑立体定位仪定位尾状核区域(以囟门为正中点，向前0.2 mm，向右旁开3.5 mm，进针深度5.5 mm)，回针0.5 mm，以10 μL/min的速度注入自体血50 μL，或放置空针作为假手术组。麻醉过后，ICH组所有的大鼠表现左侧肢体功能的瘫痪(旋转或者向左侧倒去)，证实ICH模型制作成功。

1.4 神经功能缺陷评分 前肢放置试验和轮转试验主要参照之前发表的方法[10-11]。

1.5 Western blot 取新鲜脑组织冰上裂解，充分匀浆后，蛋白样品定量。根据目的蛋白大小进行凝胶电泳。将转好的膜放入5%脱脂奶粉封闭。封闭结束，孵育相应的一抗(山羊抗PDCD4抗体购买于Santa Cruz公司，其他抗体均购置于Cell Signaling Technology)，4 ℃过夜。孵育二抗，翻板室温翻转1 h后，ECL显影。

1.6 免疫组织化学 ICH后2天的大鼠以4%多聚甲醛灌注、取脑，浸泡12 h后，20%、30%蔗糖梯度脱水。进行冰冻切片，厚度12 μm，室温保存。

免疫组织化学主要运用免疫组织化学试剂盒(购于Abcam公司)，按照说明书顺序进行，加入PDCD4孵育12 h；免疫荧光：取切片水化，0.5% Triton x-100通透细胞膜，0.1% BSA(胎牛血清)封闭后加入PDCD4、NeuN、GFAP及IBA1抗体，4 ℃孵育过夜，加入相应的二抗，荧光显微镜下拍照(德国莱卡)。

1.7 细胞培养与转染 孕18 d大鼠，乙醚麻醉后提取原代皮层神经元，培养在Neurobasal添加B27 supplement培养基中(购于Gibco公司)，每3天换液1次，培养至5 d时以100 μM hemin刺激细胞，在不同时间点收细胞。进行转染siRNA时，PDCD4 siRNA和Control siRNA运用脂质体法(lipofectamine 2000)(均由Invetrogen提供)转染进入细胞内。转染的细胞培养30 h后，hemin刺激进行收细胞检测。

2 结果

2.1 PDCD4在大鼠ICH后血肿周围组织中的表达情况 神经功能缺陷评分参照之前的研究[10-11]。图1A和图1B显示PDCD4蛋白水平在ICH后血肿周围组织中表达上调，随时间点增高呈现单峰趋势，最高点位于ICH后第2天。运用免疫组织化学的方法，本研究进一步验证了PDCD4的表达情况。从图1C～图1I中，可以观测到PDCD4主要在ICH后血肿周围区域表达增高，而血肿对侧脑域表达上调情况不明显。

2.2 PDCD4在大鼠ICH后血肿周围域的定位 ICH后血肿周围域细胞环境非常复杂，为进一步探索PDCD4在其间的作用，本研究选用免疫荧光技术检测PDCD4与哪类神经细胞相关联。图2免疫荧光双标技术分别检测PDCD4与神经元(NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)以及小胶质细胞(Iba1)的共定位情况。结果显示上调的PDCD4主要定位于神经元。

注：PDCD4为程序性细胞死亡蛋白4；a与Sham相比，差异有统计学意义(P<0.05)

图1脑出血后血肿周围域PDCD4的表达情况A为western blot检测PDCD4的蛋白水平；B为A的条形统计图；C、F为假手术(Sham)的对应区域PDCD4表达情况；D、G为ICH后2天血肿对侧区域PDCD4的表达情况；E、H为ICH后2天血肿同侧区域PDCD4的表达情况；I为C～H的统计图

注：PDCD4为程序性细胞死亡蛋白4

2.3 PDCD4与大鼠ICH后血肿周围域神经元凋亡的关系 ICH后神经功能的损伤主要表现为神经元的死亡，那么上调的PDCD4是否与神经元的凋亡相关。由此，本组检测了血肿周围域凋亡蛋白活化caspase-3的表达，以及促存活因子Akt的磷酸化情况。图3A～图3D结果显示活化caspase-3在ICH后第2天表达最高，而p-Akt在第2天表达最低。图3E免疫荧光技术检测显示活化caspase-3主要与神经元、PDCD4共定位，由此进一步证实了本组的猜想，上调的PDCD4可能与ICH后血肿周围域神经元的凋亡相关。

2.4 PDCD4在体外ICH模型中的表达 为进一步证实上调的PDCD4与神经元的凋亡存在相关性，本组构建了体外ICH模型，即血红素Hemin诱导的神经元凋亡模型。在此基础上，本研究检测了PDCD4的表达，以及活化caspase-3的表达。图4A和图4B显示PDCD4、活化caspase-3在hemin诱导的神经元凋亡模型中表达上调，并随时间逐渐增加，12 h后达最高峰。同样，图4C和图4D检测了p-Akt的表达情况，结果显示p-Akt随时间逐渐下降，于12 h达最低谷。与体内表达是一致的，由此证明血红素诱导的神经元凋亡模型(体外ICH模型)是成功的。

2.5 PDCD4在体外ICH模型中的作用 为证实PDCD4与神经元凋亡之间的因果联系。本组转染了PDCD4的特异性siRNA，图5A和图5B显示在Hemin刺激条件下，PDCD4 siRNA组PDCD4的表达明显低于Non-specific siRNA组。在此条件下，Active caspase-3表达减少，而p-Akt水平则增高。这些结果说明了PDCD4可以促进神经元的凋亡，并且可能通过p-Akt途径发挥作用的。

3 讨论

本研究发现PDCD4在ICH后血肿周围区域表达增高，并且在空间表型上主要与神经元存在共定位关系，与星形胶质细胞、小胶质细胞无共定位情况。因为ICH后神经元的凋亡/死亡是ICH疾病的最严重后果，由此本研究进一步检测了PDCD4的上调与神经元凋亡的关系。本研究发现ICH条件下，PDCD4与血肿周围域神经元、Active caspase-3之间存在时间、空间上的相关性，并且与p-Akt之间也存在一定关联。为明确PDCD4与神经元凋亡之间的因果联系，本组构建体外ICH模型，即Hemin诱导的神经元凋亡模型，运用PDCD4的特异性siRNA干预PDCD4的表达，来明确Active caspase-3、p-Akt的表达情况，结果显示PDCD4干预后，Active caspase-3随之下调，而p-Akt则上调。综上，本研究证实了在ICH条件下，PDCD4的上调与血肿周围域神经元的凋亡相关，并且是通过抑制Akt的磷酸化，抑制其促存活作用来发挥效应的。

注：PDCD4为程序性细胞死亡蛋白4；a与Sham组相比，P<0.05

注：PDCD4为程序性细胞死亡蛋白4；a与Control组相比，P<0.05

注：PDCD4为程序性细胞死亡蛋白4；a与Non-specific siRNA组相比，P<0.05

PDCD4，肿瘤抑制基因，能够结合到真核生物翻译起始因子4A1上，从而阻断RNA的结合发挥抑制蛋白质的翻译作用，因此其表达降低主要与肿瘤的增殖有关[12]。然而，越来越多的研究开始关注其在非肿瘤中的作用[13-14]。PDCD4发挥不同的作用可能与其所处的细胞环境相关。本研究证实，PDCD4在ICH后血肿周围域组织中上调，可能与促神经元凋亡相关。

PI3K/Akt通路是神经元存活过程中一条重要信号途径。PI3K的激活能够通过第二信使导致Akt从细胞质向细胞膜迁移，同时Akt活化，活化的Akt磷酸化促凋亡因子Bad，从而阻止了Bad与Bcl-2或Bcl-xl的结合，发挥促存活作用[15]。另外，激活的Akt还能够抑制caspase-9的活性，通过阻断Caspase级联反应，发挥保护作用[16]。本研究体外ICH模型中，通过siRNA干预PDCD4的表达，p-Akt水平则明显上调，由此证明PDCD4能够通过抑制Akt的磷酸化，从而发挥促凋亡作用。

PDCD4在ICH后血肿周围域发挥促神经元凋亡的作用，并且是通过下调p-Akt通路实现的。

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ExpressionandroleofPDCD4intheareaadjacenttohematomaafterintracerebralhemorrhage

ShenJiabing*,JiYuteng,ZhouTingting,CaoMaosheng,ChenYing,CaoMaohong,KeKaifu

(*MedicalSchoolofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Corresponding author:KeKaifu,Email:kekaifu_nt@126.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression,role and potential mechanism of PDCD4 in area adjacent to hematoma after intracerebral hemorrhage (ICH),and provide a molecular target for the treatment and neuronal recovery of ICH in future.MethodsProtein levels were examined by western blot and immunohistochemistry;the spatial location for proteins was detected by immunofluorescence;siRNA transfection was used to intervene in the protein in the cells.ResultsPDCD4 expression was up-regulated in the area adjacent to hematoma after ICH,and the peak of the level for PDCD4 was reached in the second day after ICH;the up-regulated d PDCD4 expression had a co-localization with NeuN,and it also had a co-localization with neuronal apoptotic protein,activated caspase-3;in the ICH model in vitro,neuronal apoptotic model induced by hemin,the expression of activated caspase-3 was decreased,and the expression of the survival factors p-Akt was increased,by intervening in the expression of PDCD4 with siRNA.ConclusionThe up-regulation of PDCD4 expression in the area adjacent to hematoma after ICH is associated with neuronal apoptosis,which might be relevant to p-Akt signaling pathway.

[Keywords]Cerebral hemorrhage；Hematoma；Programmed cell death 4；Disease models，animals

中图分类号：R743.34

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2018.03.025

基金项目：国家自然科学基金资助(81671135)；江苏省学术学位研究生科研创新计划项目资助(KYZZ16_0356)；南通大学研究生科技创新项目资助(YKC16058)

作者简介：沈加兵，博士在读，Email：shen_jia_bing@126.com

通信作者：柯开富，主任医师，教授，博士生导师，Email：kekaifu_nt@126.com

2017-12-21)