姚 晶，王科文

[硕腾（上海）企业管理有限公司，上海 长宁 200050]

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV，俗称蓝耳病病毒）是引起全球养猪行业重大经济损失的病原之一。PRRSV每年给美国养猪业带来的经济损失达10亿美元以上[1]，按照此标准估计中国每年因PRRSV造成的损失大约为50亿美元以上（中国出栏量为美国的5倍多）。然而，控制和净化PRRSV的关键一步是切断PRRSV在种猪群的循环，如此养猪生产体系才能生产出蓝耳病断奶阴性仔猪[2]。因此，有效地监测种猪群的PRRSV感染状况（母猪感染状况分类）对评估蓝耳病（PRRS）控制与净化效果是非常必要的。例如在PRRSV净化项目中，评估其进展通用的一个标准是断奶仔猪检不出病毒所需要的时间。

在过去几年里，随着采样方法和诊断技术的不断改进，猪场样品采集工作变得更加便捷。当前养猪行业对哺乳仔猪PRRSV的监测主要为血清混合样本检测，但是，在低感染率的情况下，哺乳仔猪血清混合样本对PRRSV循环的检测敏感性较低。为了提高种猪群PRRSV的检出率，养猪行业需要一个更好的检测方法。这种检测方法在保证准确性、可操作性以及成本低的情况下，检测的样本量更大、检测更频繁。因此，先是发展了更为方便可靠的口腔液样本采集检测法，该方法目前多是用在生长肥育猪以及种猪群样本的采集，而在哺乳仔猪上的使用比较少。然而，兽医和生产者仍然不断地追求更敏感、更便宜、更快的样本采集方法。最近又提出了一种样本采集新方法，即处理液（日常仔猪处理时断尾、公猪阉割滤出的液体，通常在7日龄内）样本的采集法，处理液样本采集法可以满足人们对检测方法敏感、低成本、快捷的需求。

本文将主要介绍口腔液样本检测法和组织液检测法在哺乳仔猪监测PRRSV带毒情况的最新研究进展。

1 母猪场PRRSV感染状态分类的重要性及其采样检测方法的调查

美国明尼苏达大学 MSHMP项目（Morrison Swine Health Monitoring Program）对母猪PRRS感染状态分类的重要性及其采样检测方法进行了调查[3]。该调查的对象为美国13生产体系的21位兽医工作者（这些兽医们服务的母猪群约为150万）。其中12/21（57%）和8/21（38%）的兽医分别认为母猪群感染状态的分类非常重要和重要，只有1位兽医认为其不重要。另一方面，对他们采取采样检测方法的调查结果表明，他们更多的是采用哺乳仔猪血液样本进行检测（17/21，81%），其次是采用处理液样本（11/21，52%）；一些兽医们在采集哺乳仔猪血液的同时，也采集处理液样本进行组合检测（8/21，38%）；而单纯使用哺乳仔猪血液样本进行检测的兽医比例为33%（7/21）；具体调查结果见图1[3]。从图1可以看出，主要的采样检测样本为哺乳仔猪血样和处理液样本，其次是母猪血样和口腔液样本（包括母仔口腔唾液）。虽然，调查结果表明哺乳仔猪血液样本采集比例仍然是很高，但是其作为传统的蓝耳病监测方法不仅费时、费力、费钱，而且还会引起仔猪应激甚至死亡。

图1 PRRS感染状态分类所采集不同样本的调查

2 口腔唾液（Oral fluids）样本的检测

目前有较多关于口腔唾液样本检测的文献报道。相对于费时费力费钱的血液样本，口腔唾液样本是一种成本效益好的、动物福利好的替代基于血清的监测样本。很多病原均可以在猪的口腔液中检测到，比如圆环病毒2型[4]、猪流感病毒[5]以及猪丹毒杆菌[6]等；在PRRSV方面，也有相关文献报道了相关研究[7-9]。目前，很多研究均表明基于口腔唾液的PRRSV监控在猪场是很实用的，因为口腔唾液样本采集方便及其诊断方法优化也方便。

虽然在生长肥育猪以及成年猪采集口腔唾液已经有很多相关文献报道，但是在采集哺乳仔猪口腔唾液方面的文献报告却很少。那么采集哺乳仔猪口腔唾液样本来监控母猪群PRRSV感染状况是否可行呢？

Graham等（2013）检测了一个猪群断奶前仔猪血样（44窝仔猪，共454份仔猪血样）以及每窝的口腔唾液样本；检测结果表明有两窝仔猪为PRRSV阳性，其中一窝里面只有1头仔猪血样为PRRSV阳性，而另一窝里面有2头仔猪血样为PRRSV阳性[10]；同样，Cano等（2008）对42窝仔猪的口腔唾液进行RT-PCR检测，其中检出13窝仔猪为PRRSV阳性；这13窝仔猪中有8窝包含有1头PRRSV阳性仔猪，2窝包含有2个PRRSV仔猪阳性，3窝包含有4头以上仔猪PRRSV阳性[11]。

虽然口腔唾液采样法是非常方便、快捷、低成本并可靠的采样方法，但是从哺乳仔猪获取口腔唾液样本并不是那么容易。口腔液的检测在生长猪以及成年猪（公猪、后备猪以及经产母猪）已经得到了成功的探索，而针对如何更好地获取哺乳仔猪口腔唾液的相关数据较少。

Marcelo等[12]在建立哺乳仔猪口腔唾液成功收集的标准流程方面作相关的研究。他们探索了不同采样方式[母仔共用唾液采集绳（Family oral fluids）和只有仔猪有采集绳]、采集绳中加不同诱食剂、不同采样时间以及不同绳子长度情况下，口腔唾液样本的成功采集率（最终收集到的唾液体积在0.5毫升以上）；经过他们的试验最终在提高采集哺乳仔猪口腔唾液样本成功率方面提出如下建议：1）仔猪日龄。3周龄以上仔猪比低日龄哺乳仔猪的采集成功率更高。2）采集时间。采集时间越早，成功率越高（最好在早上6：00之前）。3）不同采样方式。相对于只有仔猪能咬到采集绳，母仔共用采集绳明显可以提高采集样品的成功率；母猪起到教导的作用。4）诱食剂。在采集绳上涂花生酱略微地改善采集成功率。5）绳子高度。越靠近地板越容易采集到唾液样本。6）采集前训练仔猪。采集样本前训练哺乳仔猪可以提高样本采集成功率。

同时Marcelo等[12]比较了72窝母仔口腔唾液和窝内所有仔猪单个血清样本（699份）之间PRRSV rRT-PCR检测结果，最终检测结果显示血清样本阳性率为 24.6%（172/699），而将近一半窝数[44.4%（32/72）]仔猪中至少有1头PRRSV阳性仔猪；这32窝仔猪的母仔口腔唾液的阳性率为84.4%（27/32）；其中窝里含有3头或以上的PRRSV阳性仔猪的母仔口腔唾液也均为阳性，而窝里只有1头或2头的PRRSV阳性仔猪母仔口腔唾液阳性率为50%。因此，母仔口腔唾液的PRRSV核酸检测也可以很好地（成本低、更频繁、更多样本）用于哺乳仔猪PRRSV的监控。

3 采用处理液（Processing fluids）样本监测母猪群PRRSV感染状况

首先，处理液样本的定义为仔猪阉割和剪尾处理后的睾丸、尾巴等组织渗出液的混合样本。因为早已有研究表明PRRSV可以在睾丸上皮细胞和巨噬细胞里复制[13]，所以从理论上来讲处理液可能是PRRSV监控的合适样本。目前已有一些研究表明处理液可以很好地作为监测PRRSV的样本。

美国MSHMP项目在2017年发表相关研究课题，评估了处理液荧光定量PCR检测PRRSV来评估母猪群PRRSV感染状态的准确性，结果表明，处理液是一种用于检测哺乳仔猪PRRSV非常敏感有效的样本（只要有1头PRRSV阳性猪的处理组织在样本中，处理液的检测结果即能检出阳性），而且低胎次（1～2胎）母猪和高胎次（2胎以上）母猪之间存在显著差异，低胎次母猪阳性率更高。

Lopez等初步研究表明，与单个血清样本合样和尾巴血液拭子相比，处理液具有更高的PRRSV检出率[14]。处理液的检出率为66%（21/32），而对应的单个样本（血清和尾巴血拭子）合样具有更低的检出率，为31%（10/32）；猪场员工采集处理液操作起来更方便，采样成功率为100%，而且采集样本量足够进行多个检测。他们从18个阳性样本中获得15个PRRSV基因序列，这也说明PRRSV RNA在处理液里相对比较稳定，而且有很高的核酸量。

此外，处理液由阉割和断尾处理过程生成，那么这两种不同的处理液对PRRSV的检出率是否会有不一样呢？Hood等对比了使用睾丸和尾巴制成的两种处理液蓝耳的监测情况。他们选取了北卡罗莱纳州（美国东南部）7个不同的母猪场作为研究试验场，而且这些场都经过血清学诊断为PRRS不稳定猪场；每种处理液各采集了32份样品，用荧光定量PCR的检测方法检测，并分析其Ct值（循环阈值）；最终结果表明，睾丸处理液的检出率（53.1%）比断尾处理液（31.3%）高，而且睾丸处理液的Ct值比断尾处理液明显要低（说明病毒核酸含量更高）[15]。

PRRSV在猪群越来越稳定的时候，感染率也是越来越低，那么对于这种感染率低的猪群是否也能够很好地检测出来呢？Jacob等做了一些研究来探索很低感染率的情况下的处理液的检出率：首先他选取了已知PRRSV阳性的猪场并采集尾巴和睾丸处理液，同时采集已知PRRSV阴性猪场并采集其处理液（10窝1组，多组，PCR确定阴性）；然后将1份PRRSV 阳性处理液（Ct 22.06） 置于 10、20、30、40、50窝PRRSV阴性处理液中，取每个稀释度样本去做PCR检测；所有的PCR检测结果均为阳性；另外将1份不同Ct值的 PRRSV阳性处理液（Ct 33.56）做类似的试验，发现前面4个稀释度都是阳性，而50窝稀释度为PRRSV阴性。因此从其研究结果可看出，即使在非常低的流行率情况下，仍然能够检测出来PRRSV；但是Ct值也是会影响PRRSV的检出率的[16]。

因此，基于处理液的样本采集是筛查猪群蓝耳病的一个简单、快速、有效方法；猪场在进行PRRSV监控时，采集处理液判断猪群生产的仔猪是否到达阴性。当猪场持续监测到PRRSV循环（阳性处理液）时，警示猪场管理者和员工采取进一步管理措施阻止病毒在猪群的循环，避免PRRSV在猪群的进一步传播。

[1]Holtkamp D J,Kliebenstein J B,Neumann E J,et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers[J].J Swine Heal Prod,2013,21(2)：72-84.

[2]Corzo C A,Mondaca E,Wayne S,et al.Control and elimination of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus Res,2010,154(1-2)：185-192.

[3]Sanhueza J M,Vilalta C,Geary E,et al.Sow farm PRRS status classification survey[J].Morrison Swine Health Monitoring,2018,04.06.https：//z.umn.edu/SciencePages

[4]Prickett J R,Johnson J,Murtaugh M P,et al.Prolonged detection of PCV2 and anti-PCV2 antibody in oral fluids following experimental inoculation[J].Transbound Emerg Dis,2011,58：121-127.

[5]Panyasing Y,Goodell C K,Wang C,et al.Detection of influenza A virus nucleoprotein antibodies in oral fluid specimens from pigs infected under experimental conditions using a blocking ELISA[J].Transbound Emerg Dis,2014,61(2)：177-184.

[6]Gimenez-Lirola L G,Xiao C T,Zavala M,et al.Improving ante mortem diagnosis of erysipelothrix rhusiopathiae infection by use of oral fluids for bacterial,nucleic acid,and antibody detection[J].J Microbiol Methods,2013,92：113-121.

[7]Kittawornrat A,Prickett J,Chittick W,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in serum and oral fluid samples from individual boars：will oral fluid replace serum for PRRSV surveillance?[J].Virus Res,2010,154：170-176.

[8]Prickett J,Simer R,Christopher-Hennings J,et al.Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples：a longitudinal study under experimental conditions[J].J Vet Diagn Invest,2008a,20,156-163.

[9]Prickett J,Simer R,Yoon K J,et al.Surveillance of commercial growing pigs for PRRSV and PCV2 infections using pen-based oral fluid samples：a pilot study[J].Swine Health Prod,2008b,16：86-91.

[10]Graham J,Rademacher C,Swalla R.Use of oral fluid sampling in suckling pigs for PRRSV monitoring[C].Proceedings Seminar of American Association of Swine Veterinarians,San Diego,CA,2013：83-89.

[11]Cano J P,Dee S A,Rovira A,et al.PRRSV vertical transmission dynamics in an endemically infected sow-herd[C]//In：Proceedings Seminar of American Association of Swine Veterinarians,San Diego,CA,2008：105.

[12]Marcelo A,Jeffrey Z,Derald H,et al.Comparative evaluation of family oral fluids and piglet sera to detect PRRSV RNA by PCR[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：339.

[13]Sur J H,Doster A R,Christian J S,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus replicates in testicular germ cells,alters spermatogenesis,and induces germ cell death by apoptosis[J].J Virol,1997,71(12)：9170-9179.

[14]Will A,Jose A,Clayton J,et al.Processing fluids for PRRSV monitoring and surveillance systems[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：61.

[15]Hood M,S Hough,J.Angulo,et al.Comparison of the use of tails versus testicles in the production of processing fluids for detection of PRRSV[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：99.

[16]Jacob B,Deb M,Amanda S,et al.Utilizing piglet-processing fluids to detect PRRSV by PCR in a low-prevalence population[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：95.