段会勇

（泰山职业技术学院，山东 泰安 271000）

空气是人类和畜禽赖以生存的重要因素之一。微生物对人类和畜禽健康及生产性能的影响在很多情况下是通过空气污染造成的，空气微生物的污染程度是衡量空气质量的重要标志之一[1]。微生物是动物舍环境污染的主要因素，动物舍的生物污染可以引起一系列传染病的流行。动物舍空气中的细菌包括致病菌、条件性致病菌和非病原菌[2]，它们在一定程度上均可导致动物或饲养员的感染[3]；甚至极少量的致病菌就可直接导致呼吸道的感染，特别是下呼吸道的感染[2]。所以，空气中微生物气溶胶的污染，不仅能够影响人及其他动物的健康，而且使一些传染性人兽共患疾病病原体在人和动物间传播[4-5]。

大肠埃希氏菌是人和动物肠道中的一种共栖菌，在特定条件下可致大肠杆菌病，并能够随着粪便排出而污染环境。因此，大肠埃希氏菌是农业环境、水、食品等污染的重要指示细菌[6-8]。大肠埃希氏菌在空气中，特别是在动物舍及其周围环境中是一种常见菌[9-10]。

动物舍环境中的微生物及其代谢产物形成的气溶胶不仅能够导致环境污染，影响动物的健康及生产性能，而且还能导致气源性传染病的流行。过去对畜禽养殖环境微生物气溶胶传播的研究主要是通过舍内外环境中的细菌浓度的变化以及细菌耐药性及某些致病菌含量等方面来确认的，很少利用分子生物学手段研究畜禽舍微生物气溶胶向环境的传播。本试验通过多重PCR方法调查了不同猪舍内外环境中大肠杆菌的5种主要毒素基因的携带情况，而且还通过对舍内、舍外环境中大肠杆菌的5种主要毒素基因的比较检测分析，研究舍内大肠杆菌5种主要毒素基因向舍外环境中的传播。

1 材料和方法

1.1 猪舍情况

本研究于2015年6月至2017年6月在泰安和莱芜5个不同养猪场，分别设点采样，风速、温度及相对湿度在取样开始、中间及即将结束时分别测量。猪舍的具体情况分别见表1。

表1 猪舍物理指标

1.2 样本的采集

利用Andersen-6级撞击式和LWC-I离心式空气微生物采样器收集空气样品。空气样品分别取其舍内、舍外上风（10 m和50 m）、舍外下风方向（10 m、50 m、100 m、200 m、400 m）。采集时间根据环境卫生状况不同掌握在1～5 min之间，尽量使每个平板上的菌落数在30～300为宜。每个猪舍设3点采样，每次重复采集5个样本。每一个猪舍在采集空气样本的同时随机采集了10～15个粪便样本。

1.3 空气中大肠杆菌的分离、鉴定与浓度计算

用麦康凯3号培养基采集的样本（平板和试条）在37℃条件下培养24 h后，所有的红色菌落经过“KOH反应”试验鉴定其是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌。所有革兰氏阴性短杆菌再在麦康凯培养基上进行一次纯分离培养，通过普通的生化试验进行鉴定，不确定的菌株再用API 20 E（Bio Merieux,Marcy-I'Etoile,France）鉴定，统计大肠杆菌的数量，并根据公式①计算出每立方米空气中大肠杆菌的含量（CFU/m3），最后将含20%甘油的肉汤培养物保存在-20℃冰箱中。

其中Q1为六节平皿上菌落数量矫正后的总和，t为采样时间（min）。

1.4 粪便中大肠杆菌的分离、鉴定与浓度计算

取粪便样本约0.5 g，加入预先盛有4.5 mL检样稀释液的灭菌青霉素小瓶中，用同样稀释液对样品做连续10倍递进稀释至10-6。用移液器（50 μL）从高稀释度开始，滴种麦康凯培养基上，每个培养基用3个平板，每个平板上滴3个稀释度，每个稀释度3滴，每滴之间间隔一定距离成3×3方阵形。37℃培养18～20 h后按照可数性原则对相同稀释度的3滴样本的菌落进行计数，选择合适的稀释度，按下列公式②计算每克样品所含细菌数。

根据Lim介绍的方法[11]，将稀释液先接种到伊红美蓝培养基上37℃培养18～20 h，挑取黑色带金属闪光的菌落接种到麦康凯3号（OXOID）培养基上37℃培养18～20 h后，每一平板挑取1～2个典型红色菌落，并根据1.3方法鉴定保存。

1.5 大肠杆菌培养及模板DNA的提取

1.5.1 大肠杆菌培养 取试验中分离提纯后保存的菌种，接种于麦康凯培养基上，37℃培养24 h后，挑取生长的单个粉红色菌落接种于LB肉汤中，37℃培养过夜。

1.5.2 模板制备 将大肠杆菌接种到5 mL LB培养基中振荡培养18 h。然后取出培养液1.5 mL 10 000 r/min离心2 min，弃掉上层液体，用100 μL TE缓冲液洗涤2次，去掉洗涤液，最后再用100 μL TE缓冲液悬浮沉淀，在100℃条件下煮沸10 min，再迅速冰浴5 min，最后12 000 r/min离心2 min，取出上清液作为模板在-20℃条件下保存备用。参考菌株 C83600（STb、LTa），C83710（STa），H30（Stx1），SDZ21（LTa、Stx2），SDZ15（Stx2）由山东农业大学预防系实验室保存。

1.6 PCR 反应

1.6.1 引物的合成 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表2。

表2 试验中所用引物序列

1.6.2 反应条件 ERIC-PCR反应体系由以下成分组成：1×buffer，200 μmol dNTPs，1.5 U Taq DNA 聚合酶，1.5 mmol MgCl2（TaKaRa），5对引物各25 pmol，2 L模板DNA，最后用灭菌双蒸水补充至25 μL。反应参数：95℃预变性 3 min，94℃变性 30 s，58～54℃（每两个循环下降1℃）复性1 min，72℃延伸1 min，共32个循环，72℃延伸10 min结束反应。进行电泳之前，所有PCR反应产物在4℃条件下保存。

1.6.3 电泳 PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离（1xTAE为电泳缓冲液，EB染色，3 V/cm条件下电泳 1～2 h），以 DL 2 000 Marker（TaKaRa）作为分子量标准，电泳结果在紫外分析仪上照相。

2 结果

2.1 猪舍环境中大肠杆菌5种主要毒素基因的检测结果

图1显示了在同一PCR反应条件下，5种毒素基因的检测结果，它们可以分别扩增出各自的条带。5 种不同毒素基因 STa、STb、LTa、Stx1 和 Stx2/Stx2e扩增条带的大小分别为 183 bp、360 bp、282 bp、664 bp和484 bp。图2显示了用多重PCR法检测大肠杆菌5种毒力基因的携带情况。

图1 多重PCR对大肠杆菌5种毒素基因的检测结果

图2 多重PCR对大肠杆菌5种毒素基因的检测结果

由表3可知，在检测的5个猪舍环境中的120株大肠杆菌中，很多菌株仅仅携带1个毒素基因：有11.67%（14/120） 的菌株携带 LTa 基因，17.50%（21/120）的菌株携带 STb 基因，1.67%（2/120）的菌株携带 STa基因，5.00%（6/120）的菌株携带 Stx2/Stx2e基因。但是，很多菌株携带2个或2个以上的毒素基因：携带STa+STb、STa+STb+LTa和STb+LTa+STx1菌株都占 3.33%（4/120），还有 6.67%（8/120）的菌株携带 STa+LTa基因，5.83%（7/120）的菌株携带 LTa+Stx2/Stx2e 基因，1.67%（2/120） 的菌株携带 STa+LTa+STx1 基因，2.50%（3/120）的菌株携带 STa+STb+LTa+STx1 基因，并且还有 37.50%（45/120）的大肠杆菌没有检出这5种毒素基因。结果也同时表明，携带LTa基因和STb基因的菌株最多，分别为35.00%（42/120）和 30.00%（36/120）。

表3 猪舍环境中大肠杆菌5种主要毒素基因的检测结果

2.2 猪舍内外大肠杆菌5种主要毒素基因的比较

通过比较发现，有很多从舍内分离的大肠杆菌与粪便中分离的大肠杆菌携带相同的毒力基因，比如：在猪舍A内，大肠杆菌indoor（舍内）-3，-4与feces（舍外）-6；在猪舍B内，大肠杆菌indoor-1与feces-9；在猪舍C内，大肠杆菌indoor-5与feces-7，indoor-3与feces-2；在猪舍D内，indoor-9与feces-5；在猪舍E内，indoor-3与feces-5，等等。另外，很多从下风方向分离到的大肠杆菌与舍内分离的大肠杆菌或粪便中分离的大肠杆菌也携带相同的毒力基因，如：在猪舍B内，downwind10 m（下风方向10 m）-1与indoor-8；在猪舍 C 内，downwind10 m-2 与 feces-5，downwind50 m（下风方向 50 m）-2 与 feces-6，downwind10 m-3与feces-9；在猪舍D内，downwind10m-1与feces-8和indoor-7；在猪舍E内，downwind10 m-3与feces-6。但是，在5个猪舍中，有一些从舍外下风分离到的大肠杆菌与舍内分离的大肠杆菌或粪便中分离的大肠杆菌的携带毒力基因并不相同，所以，这些下风分离株应当不是来源于舍内空气。

3 讨论

大肠埃希氏菌是引起动物腹泻与死亡的重要病原体，自Kaufmann在21世纪50年代建立的大肠埃希氏菌血清型分类系统以来，血清型一直作为致泻性大肠埃希氏菌的鉴定依据及流行病学调查的标志。而大肠埃希氏菌的毒力主要取决于是否携有相应的毒素，因此毒素的检测成为鉴别病原性大肠埃希氏菌的重要依据。

本试验采用多重PCR方法，以多对引物在同一反应体系中扩增几种不同的毒素基因，可简化操作步骤，缩短时间，快速定型。本试验根据已经发表的序列设计了5种大肠杆菌肠毒素基因特异引物，并建立了Multiplex-PCR方法，旨在用于动物舍环境中大肠杆菌毒素基因的分子流行病学调查，并研究动物舍舍内大肠杆菌毒素基因向舍外环境中的传播。

通过对不同猪舍舍内及其环境中大肠杆菌毒素基因的检测可以看出，在携带这5种毒素基因的所有大肠杆菌中，携带LTa基因的菌株最多，而且绝大多数大肠杆菌携带2种或2种以上的毒素基因，携带Stx2/Stx2e毒素基因的菌株最少。本试验结果表明，用建立的Multiplex-PCR方法不仅能同时检测并区分大肠杆菌的这5种毒素基因类型，而且能检测一种或任何组合的毒素基因，这对大肠杆菌毒素类型的快速普查具有重要的应用价值，对临床诊断具有一定的指导意义。

通过对猪舍舍内（动物粪便和舍内空气）及其内外环境中大肠杆菌毒力基因的检测结果比较后可以看出，舍外环境中的，特别是下风中检测的大肠杆菌其携带的毒力基因类型与舍内或动物粪便中的大肠杆菌其携带的毒力基因类型相同。因此，我们可以推测其是猪舍环境中的大肠杆菌传播到舍外环境。这对牧场周边环境可能造成一定污染，对波及到的牧场猪群或邻近的居民的健康构成潜在的危害，其程度及机制有待进一步研究。以大肠杆菌作为一种指示菌来研究猪舍中微生物气溶胶向周围环境的传播，具有兽医公共卫生学和流行病学意义。

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