赵 祥,于 洁,胡 静,许静秀,韩彩霞,李晓云,宋铭忻

(1.东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.家畜疫病病原生物学国家重点实验室,甘肃 兰州 730046)

旋毛虫(Trichinella spiralis)是一种全球性分布的人兽共患线虫病,严重感染时可致人死亡。宿主因食用了生的或未煮熟的含有包囊型肌幼虫的肉后而感染。旋毛虫感染过程中必须经历胃部的极酸环境(pH值2～3),其对酸性环境的耐受机制现未清楚[1]。目前研究较为深入的抗酸机制是大肠杆菌,大肠杆菌主要有4种抗酸系统:葡萄糖抑制抗酸系统、谷氨酸依赖型抗酸系统、精氨酸依赖型抗酸系统、谷氨酰胺依赖型抗酸系统,当大肠杆菌处于酸性环境时,会诱导体内多种抗酸系统的协同作用,从而在酸性环境中存活[2]。旋毛虫肌幼虫与大肠杆菌同样作为食源性病原体,有关大肠杆菌的抗酸研究启发我们旋毛虫体内或许存在类似抗酸系统来抵抗胃液的酸性环境,从而感染宿主致病。

谷氨酰胺作为一种非必需氨基酸在食物中广泛存在且含量丰富,谷氨酰胺酶对谷氨酰胺的催化水解是谷氨酰胺依赖型抗酸系统中重要步骤[3]。本实验通过在酸性环境下培养旋毛虫肌幼虫,应用实时荧光定量PCR和免疫荧光技术对旋毛虫谷氨酰胺酶(T.spiralisglutaminase,TsGLS)表达量进行分析,为进一步阐明旋毛虫抗酸机制提供线索。

1　材料与方法

1.1材料与试剂 旋毛虫分离自黑龙江猪旋毛虫虫株(编号:ISS533),由本实验室经昆明系小鼠传代保存。TsGLS多克隆抗体由本实验室制备保存。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗家兔IgG(二抗),购自北京中杉金桥生物技术有限公司;rTaqDNA聚合酶、pMD18-T载体试剂盒、TRIZol和 SYBR®PremixEx TaqTMII,购自宝生物工程(大连)有限公司;PCR仪为德国Eppendorf公司产品;岛津UV-120-02型紫外分光光度计为日本岛津公司产品;ABI7500实时荧光PCR仪为Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.2引物设计与合成 参照GenBank上发表的旋毛虫TsGLS mRNA参考序列(ACCESSION:XM_003375164)和 TsGAPDH mRNA参考序列(登录号:AF452239.1),利用Primer 5.0软件设计引物。TsGLS基因荧光定量上游引物:5′-ATCCGAACAAGGGCAACTG-3′,下游引物:5′-CGGCACTGATACCAAACCAT-3′,预期扩增片段长度为149bp;TsGAPDH基因荧光定量上游引物:5′-TGGCTTAGCTCCGTTGG-3′,下游引物:5′-TTTGGGTTGCCGTTGTA-3′,预期扩增片段为 92 bp。上述引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3旋毛虫肌幼虫的收集与培养 取感染旋毛虫肌幼虫40 d的昆明系小鼠5只处死,剔出肌肉,经组织捣碎机打碎,收集肉液中游离出的旋毛虫肌幼虫。将收集到的虫体用DEPC水洗涤3次,以1 000条肌幼虫/1 mL/孔,分别放入 pH 值为 2.5、4.0、6.6和9.0、含生理盐水的24孔细胞培养板内,于37℃、5%CO2培养箱内培养 0.5 h、1 h、3 h 后,收集虫体,放入4℃冰箱备用[4-5]。

1.4旋毛虫总RNA的提取和反转录 将上述虫体于加液氮的灭菌研钵中研磨,按照TRIZol Reagent RNA试剂盒操作说明书,提取旋毛虫总RNA,测定OD值及 RNA 浓度(D260nm/D280nm在 1.8～2.1之间)。利用旋毛虫总RNA进行反转录,并以其为模板进行PCR扩增。

1.5实时荧光定量PCR检测

1.5.1标准品的制备 用旋毛虫cDNA为模板扩增TsGLS和TsGAPDH基因:95℃10 min;95℃ 30 s;60℃30 s和72℃ 30 s,29个循环;最后72℃10 min;反应结束后4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将验证正确的PCR产物回收后与pMD18-T载体于16℃连接过夜,转入大肠杆菌DH5α中,将PCR和双酶切鉴定正确的克隆菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序,并命名为pMD18-T-TsGLS和pMD18-T-Ts-GAPDH,利用生物软件进行序列比对,将阳性菌液-80℃冻存[6]。

使用全式金生物技术有限公司的柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒,用分光光度计测定上述两种质粒的浓度。将质粒进行10倍系列稀释5个梯度,分装后保存于-20℃备用。

1.5.2标准曲线的建立 用稀释好的不同梯度标准品为模板,PCR的反应条件依照SYBR®PremixEx TaqTMII试剂盒推荐的方法:反应体系为20 μL,SYBR®PremixEx TaqTMII(Tli RnaseH Plus)10 μL,上 下 游 引 物 各 0.5 μL,ROX Reference Dye II 0.4 μL,稀释后的模板 0.5 μL,ddH2O 8.1 μL。 反应程序为:95℃预变性30 s;95℃变性5 s;60℃退火34 s;40个循环后进行熔解曲线分析。以其模板质粒标准品浓度(lg)作为X轴,其所对应的Ct值作为Y轴,即可得出相应的标准曲线[7]。

1.5.3待测样品的检测 将各组样品逆转录合成的cDNA作为模板,每个样品均设置3个重复反应,分别以TsGLS和TsGAPDH为引物进行实时荧光定量PCR。

1.6数据分析 应用EXCEL、SPSS 21.0和Image J软件对试验数据进行统计和分析。

1.7酸性条件旋毛虫免疫荧光信号检测 分别将pH值2.5生理盐水培养3 h(酸处理组)与pH值6.6生理盐水培养3 h(正常组)的旋毛虫进行免疫荧光检测。吸取少量旋毛虫于粘附载玻片,用盖玻片轻轻按压后,4%多聚甲醛处理10 min,4℃预冷甲醇5 min,PBS洗3次每次10 min。1%Triton X-100处理5 min后用山羊血清封闭1 h。一抗用自制的 TsGLS多克隆抗体孵育(1∶1 000),二抗用FITC标记山羊抗兔(1∶1 000)。抗荧光淬灭封片剂封片后于荧光显微镜下观察,图像采集时保证所有参数一致。

2　结果

2.1TsGLS基因片段的扩增和pMD18-T-TsGLS重组质粒的鉴定 经RT-PCR扩增,获得大小为149 bp的基因片段,与预期目的基因大小相符(图1)。目的基因克隆后进行酶切鉴定与测序,证实该插入片段与TsGLS基因序列一致。

图1　TsGLS基因PCR产物

图2　TsGAPDH基因PCR产物

2.2TsGAPDH基因片段的扩增和pMD18-T-Ts-GAPDH重组质粒的鉴定 提取肌幼虫总RNA,逆转录后扩增TsGAPDH目的片段,大小为92 bp,与预期目的基因大小相符(图2)。目的基因克隆后进行酶切鉴定与测序,证实结果与预期一致。

2.3标准曲线的制作 分别以pMD18-T-TsGLS及pMD18-T-TsGAPDH重组质粒的标准品进行实时荧光定量PCR。将两种标准品倍比稀释,根据其模板数与Ct值之间存在的线性关系(y代表Ct值;x代表起始模板数),得到标准曲线,直线回归方程如下:

TsGLS mRNA:y=-3.3260x+10.1010(R2=0.999),TsGAPDH mRNA:y=-3.2630x+12.1440(R2=1)。

结果显示,这两条标准曲线的一致系数R2均接近1.000,TsGLS和 TsGAPDG扩增效率分别为99.81% 和 102.53%,在 0.8 ～ 1.2 之间,都接近100%,符合△△Ct法相对定量分析的标准,因此本实验采用△△Ct法进行表达差异分析[8]。

图3　TsGLS基因的标准曲线

图4　TsGAPDH基因的标准曲线

2.4不同pH值对TsGLS mRNA表达水平的影响

利用实时荧光PCR对酸性条件下培养的肌幼虫TsGLS的表达量进行检测,得到各检测样品Ct值,以pH值6.6生理盐水培养0.5 h的肌幼虫相对表达量作为空白对照组,△△Ct法对试验结果进行分析。

如图5 所示,pH 值 2.5、pH 值 4.0、pH 值 6.6和pH值9.0 TsGLS mRNA相对表达量的变化趋势相似,在相同培养时间内,随着pH值的降低,TsGLS mRNA表达量逐渐升高,pH值2.5时TsGLS mRNA表达量显著高于其他各组(P＜0.01);在0.5 h和1 h 时,pH 值4.0、pH 值6.6、 pH 值9.0 三组之间相比较,TsGLS mRNA表达量变化差异并不显著(P＞0.05);在3 h时,pH值4.0相比pH值6.6和pH值9.0有明显升高。在pH值相同时,TsGLS mRNA相对表达量随着培养时间的延长而呈升高趋势,且在pH值2.5条件下培养3 h时相对表达量最高。

2.5酸性条件旋毛虫免疫荧光信号强度分析 免疫荧光信号显示,酸处理组的旋毛虫在荧光显微镜下显示出明显的绿色荧光,而正常组的旋毛虫荧光信号较弱,明显暗于酸处理组(见中插彩版图6)。

图5　不同pH值对TsGLS mRNA相对表达量的影响

将两组图片分别经Image J软件分析后,计算各组旋毛虫肌幼虫光密度平均值,发现酸处理组明显高于正常组,差异极显著(P＜0.01)(表1)。

表1　TsGLS荧光信号光密度平均值分析

3　讨论

Gorden等人[9]将细菌的抗酸性定义为细菌暴露在低于pH值2.5的环境下2 h后,存活率超过10%,即认为其具有抗酸能力。旋毛虫作为一种食源性病原体,对胃酸具有一定的耐受能力。在pH值2.5条件下培养旋毛虫3 h时,旋毛虫仍有45%的存活率[10]。

传统的旋毛虫收集方法是将小鼠肌肉搅碎后用人工胃液消化,经贝尔曼氏装置收集。为避免人工胃液的酸性环境对旋毛虫的刺激作用,我们将小鼠肌肉搅碎后直接在显微镜下挑取,保证了实验结果的准确性。将获得的旋毛虫在酸性条件下培养后,经实时荧光定量PCR分析发现,酸性条件能够明显诱导旋毛虫体内谷氨酰胺酶的表达。且在与胃酸接近的pH值2.5时,谷氨酰胺酶的表达量有着明显的升高。此外,荧光信号分析也显示,pH值2.5生理盐水培养后的旋毛虫荧光强度明显高于pH值6.6生理盐水组,表明在酸性组中旋毛虫谷氨酰胺酶含量明显升高。谷氨酰胺依赖型抗酸系统是大肠杆菌体内重要的抗酸系统之一,Lu Peilong等人研究发现,在极酸性培养基中(pH值2.5)培养大肠杆菌时,单独加入谷氨酰胺即可保持细菌较高的存活率[11]。谷氨酰胺在肉类、蔬菜、水果等食物中均具有很高的含量,大肠杆菌利用氨基酸反向转运蛋白GadC吸收Gln,胞内的谷氨酰胺酶(YbaS)催化 Gln水解为谷氨酸(Glu)和NH3并消耗H+;Glu被GadC转运出胞外并继续转入Gln。谷氨酰胺的转运和水解过程能够帮助大肠杆菌维持体内的酸碱平衡[3、12]。本研究结果揭示,谷氨酰胺酶对旋毛虫耐受酸性环境具有重要作用,旋毛虫存在类似大肠杆菌的谷氨酰胺依赖型抗酸系统来保护酸性环境对其自身损伤。