吴佳琦,李贝影,王介淞,黄 娟,单 虎

(青岛农业大学动物医学院 山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心,山东 青岛 266109)

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,能够引起宿主的多个系统器官发生病变[1]。在自然条件下,犬瘟热病毒能够使犬科(犬、狐狸、豺、狼)、鼬科(鼬鼠、雪貂、水貂、水獭等)、浣熊科(浣熊、熊猫)、猫科动物(如狮子、虎)等多科动物及海狮和猴发生感染[1-3]。敏感动物感染犬瘟热病毒后,典型症状是双相热,并出现抽搐、口吐白沫等神经症状和不同程度的胃肠炎、卡他性肺炎,其高发病率、高死亡率的流行特点对毛皮动物养殖业及野生动物保护都造成了巨大损失。

犬瘟热病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属,为单股负链不分节段RNA病毒,基因组全长15 690 bp,呈线性排列,3′端为前导序列,5′端为尾随序列,两序列之间为6个非重叠基因区,主要编码6个结构蛋白,分别为核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质膜蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝素蛋白(Hemagglutinin protein,H)和大蛋白(Large virusspecifiedRNAdirectedRNApolymeraseprotein,L)[3]。病毒囊膜表面附着有长约1.3 nm的糖蛋白纤突,纤突由H蛋白和F蛋白组成,二者在感染性病毒吸附和侵入宿主细胞的过程中发挥了重要作用。

Vero细胞常用来分离犬瘟热病毒,但犬瘟热病毒强毒株在Vero细胞上连续传代之后常导致毒力降低或丢失,而稳定表达犬瘟热病毒受体-信号淋巴细胞激活因子(Signalling lymphocyte activation Molecule,SLAM)的Vero-SLAM细胞能提高该病毒的分离率[4],因此成为目前分离犬瘟热病毒的首选细胞,但犬瘟热病毒强毒分离株在Vero-SLAM细胞上连续传代之后是否会发生基因突变尚无报道。本试验对在Vero-SLAM细胞传代培养了12代的犬瘟热病毒强毒株进行全基因克隆和测序,并与该毒株的原始序列进行对比,分析该毒株在Vero-SLAM细胞上传代培养有无发生基因突变,为犬瘟热病毒强毒株的分离提供依据,获得的全基因组基因序列也为反向遗传学进行病毒拯救奠定了基础。

1　材料与方法

1.1毒株及试剂 犬瘟热病毒强毒株Hebei株(KC427278)在Vero-SLAM细胞上传代培养12代,由本实验室保存。RNAiso plus裂解液、M-MLV(Reverse TranscriptaseM-MLV)、5 × ReverseTranscriptase M-MLV Buffer、RRI(Recombinant RNase Inhibitor)、dNTP Mixture、10 ×Ex TaqBuffer(Mg2+)、Ex TaqDNA Polymerase、DL-5 000 DNA Marker 和DNA凝胶回收试剂盒TaKaRa MiniMEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、三氯甲烷(氯仿)、异丙醇、75%乙醇、LB液体培养基、pMD18-T Vector载体试剂盒、DH 5α大肠杆菌感受态细胞、SOC培养基,均购自TaKaRa公司。

1.2引物的设计与合成 根据犬瘟热病毒Hebei株(KC427278)的核苷酸序列,并参考其他CDV基因组全序列,毒株名称和登录号分别为CDV SY(KJ466106)、LN(10)1(KP765764)、98-2654(AY466011)、SD(14)7(KP765763)、CDV-RDJL(KJ848781)、HLJ1-06(JX681125)、panda/SX/2014(KP793921)、SD(14)11(KP738610)、CDV-L(KM926612),使用 Primer 5.0在保守区设计10对引物(表1),交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,用于扩增CDV全基因,按照合成报告加灭菌双蒸水稀释,放在-20℃保存备用。

表1　犬瘟热病毒Hebei株全基因扩增引物

1.3病毒RNA的制备及cDNA的合成 应用RNAiso plus法对犬瘟热12代细胞病毒液进行总RNA的提取。吸取250 μL病毒悬液加上750 μL RNA裂解液,颠倒混匀6～8次,冰上静置5～10 min。12 000 r/min(4℃)离心5 min后吸上清600 μL至新1.5 mL离心管中,加入4℃保存的三氯甲烷溶液200 μL,震荡混匀后冰上静置5 min。12 000 r/min(4℃)离心15 min后,吸取上清液300 μL至新的1.5 mL 离心管中,加入 300 μL 等量的异丙醇后,移至-20℃冰箱放置40 min。12 000 r/min(4℃)离心10 min,弃掉上清液,向管中加入4℃保存的75%乙醇1 mL,7 500 r/min(4℃)离心5 min,弃去上清液,室温干燥,最后加入20 μL去离子水,震荡混匀-20℃保存备用。反转录总体系为20 μL,其中 ddH2O 5.5μL,5 × Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 4 μL,dNTP Mixture 2 μL,上游引物1 μL,下游引物 1 μL,RRI 0.5 μL,M-MLV 1μL,提取的总RNA模板5 μL。42℃水浴60 min,72℃10 min进行反转录,之后于-20℃保存备用。

1.4基因片段的扩增 以cDNA为模板应用表1的特异性引物分别扩增1～10个片段。PCR反应体系为 25 μL:其中 ddH2O 16 μL,10 ×Ex TaqBuffer(Mg2+)2.5 μL,dNTP Mixture 2.0 μL,上游引物 1 μL,下游引物 1 μL,Ex TaqDNA Polymerase 0.5 μL cDNA 模板2 μL。 PCR 反应条件为:94 ℃预变性5 min,94℃变性30 s,退火52℃～59℃30 s,延伸1～4 min,35个循环后,终延伸72℃10 min,最后4℃保存。用胶回收试剂盒从凝胶中纯化扩增产物。

2　结果

2.1CDV Hebei全基因组各片段的克隆以及鉴定应用设计的10对引物,对Hebei株进行RT-PCR扩增,用1%琼脂凝胶电泳后,获得与预期大小相符的片段(图1)。

图1　Hebei株基因组不同片段的RT-PCR扩增结果

2.2Hebei株全基因组序列的拼接 对10个重叠片段测序和拼接,获得了 Hebei株基因组全长15 690 bp序列,包括52 bp的3′前导序列,38 bp的5′尾随序列及6 种结构蛋白 N、P、M、F、H、L,基因大小分别为 1 683 bp、1 655 bp、1 442 bp、2 205 bp、1 947 bp、6 573 bp。

2.3全基因核苷酸序列以及氨基酸分析 将传代12代的HeBei分离株的全基因序列与GenBank上Hebei株全基因进行序列比较分析,结果表明,病毒传代后较原始序列有24处碱基突变,14处氨基酸突变(表2)。

3　讨论

CDV属于RNA病毒,在自然条件下及细胞培养时容易发生变异,因此在病毒传代过程中应密切监测其变异情况。本研究对Hebei株在Vero-SLAM细胞连续传代,通过RT-PCR获得了覆盖其全长基因组的10个末端重叠的片段,拼接得到Hebei株全长cDNA序列,并与GenBank上的Hebei毒株原始序列比对。结果表明,传代后的序列较原始序列有24处碱基突变,其中3处为非编号码区的突变,其余21处在编码区;碱基突变率分别为N 0.00%、P 0.12%、M 0.06%、F 0.36%、H 0.21%、L 0.12%;碱基的突变导致14处氨基酸的突变,其中,N蛋白氨基酸无突变,P、M、F、H、L蛋白氨基酸突变率分别为 0.39%、0.30%、0.60%、0.50%、0.18%,表明犬瘟热病毒Hebei株在Vero-SLAM细胞上连续传代,突变主要发生在F上。

在自然环境中,犬瘟热病毒H蛋白突变率在所有结构蛋白中最高,因此H蛋白基因序列常用来构建基因系统发育树[5]。本研究表明,犬瘟热野毒株Hebei株在Vero-SLAM细胞上连续传代后突变主要发生在F蛋白上。F蛋白位于犬瘟热病毒囊膜上,呈纤突状,是感染性犬瘟热病毒粒子感染宿主细胞所必需的成分,病毒通过H蛋白识别、吸附于细胞表面的CD150/SLAM受体,接着与F蛋白协同时病毒囊膜与宿主细胞膜发生融合,完成病毒感染第一步。F蛋白基因序列的变异可能是病毒适应细胞的结果,强毒株在细胞上连续传代后获得致细胞病变效应。F蛋白编码区由3个部分组成:Fsp区域(aa 1～135),两个亚单位 F2(aa 136～224)和F1(aa 225～662),这是通过翻译后蛋白水解产生的。自然环境中,犬瘟热病毒野毒株F蛋白突变主要发生在Fsp区域[6],本研究表明犬瘟热病毒强毒株Hebei株在Vero-SLAM细胞上连续传代后突变主要发生在F蛋白的F1亚单位,说明犬瘟热病毒的基因突变机制在自然环境下和细胞传代培养后是不同的。

表2　Hebei株的核苷酸和氨基酸突变位点

病毒基因组序列蕴含大量的信息,在分子流行病学中起着重要作用,病毒的全基因组序列为构建反向遗传系统、病毒载体的构建以及利用反向遗传学改造病毒成为疫苗株提供理论依据。

参考文献: