庞 燕，王海军，冯维贵，王玉斌

（甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000）

叶酸受体是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，分子量为38～40 kD，包括α、β和γ/γ′3种亚型。叶酸受体基因表达有很强的组织和肿瘤特异性，在正常组织中低表达，而在一些肿瘤组织中高表达，α亚型在正常组织中低表达，在上皮细胞系肿瘤，例如卵巢癌、肾癌、睾丸癌、脑癌、结肠癌中高表达；β亚型仅在胎盘、粒单核细胞系中成熟的中性粒细胞、被激活的单核或巨噬及超过半数以上的髓系白血病细胞中高表达，在其他组织中几乎不表达；γ/γ′亚型被认为是特异性表达在造血组织中，但也只是低表达[1，2]。

1 叶酸受体肿瘤显像剂的研究进展

目前已报道的用于标记叶酸受体放射性药物的核素有66/67/68Ga，111In，99mTc及18F 等。

1.1 66/67/68Ga标记的显像剂

1.1.1 66/67/68Ga-DF-folate C J Mathias等报道，67Ga和66/68Ga与DF-folate（DF，去铁胺）偶联后可以作为叶酸受体肿瘤显像剂进行显像，DF-folate结构如图1所示。67Ga-DF-folate在荷KB细胞（人体口腔上皮癌细胞）肿瘤小鼠体内，肿瘤中摄取较高[（5.2±1.5）%ID/g，4 h p.i]，瘤/血比和瘤/肉比分别为409±195和124±47。同时，文献报道66Ga和68Ga亦可以用来标记DF-folate，其中 66Ga-DF-folate在荷KB细胞肿瘤小鼠的MicroPET显像中，肿瘤和肾脏的显像清晰，具有很高的灵敏性[3，4]。

图1 DF-folate的结构

1.1.2 67Ga-DOTA-Bz-EDA-folate 2011年，Cristina Muller等标记得到67Ga-DOTA-Bz-EDA-folate（结构如图2所示）。体外细胞结合实验中，此标记物对叶酸受体表现出较强的亲和力。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，67Ga-DOTA-Bz-EDA-folate在肿瘤中摄取较高[（6.08±0.89）%ID/g，4 h p.i]，并且滞留时间较长[（5.54±0.36）%ID/g，24 h p.i]。除了唾液腺和肾脏中特异性摄取较高外，非靶器官摄取很低，4 h瘤/血比为56.28±9.04。由于肾脏特异性摄取较高，会影响显像效果并对肾脏产生毒副作用，笔者提前注射培美曲塞，达到了降低肾脏摄取的目的，4 h瘤/血比由84.53±14.10降到19.09±1.63，同时肿瘤中摄取变化不大，由（6.08±0.89）%ID/g变为（6.15±0.77）%ID/g。荷瘤小鼠SPECT显像结果与生物分布结果一致，标记物能清晰显示肿瘤位置，提前注射培美曲塞后肿瘤显像依然清晰，但是肾脏摄取量大大降低[5]。

图2 DOTA-Bz-EDA-folate的结构

1.2 111In标记的显像剂

1.2.1111In-DTPA-folate111In-DTPA-folate是第一个进入并完成Ⅱ期临床试验的叶酸受体肿瘤显像剂。DTPA-folate结构如图3所示。2003年，Siegel BA等对111In-DTPA-folate作为诊断卵巢癌的一种显像剂就其安全性、生物分布和可能性进行研究。结果发现，33例卵巢癌患者中，111In-DTPA-folate对恶性卵巢实体瘤诊断的灵敏度达100%。这种显像剂能很好地区分良、恶性肿瘤，但在诊断再发性卵巢癌和子宫内膜恶性实体瘤时，效果不太理想。111In为利用加速器生产的放射性核素，且半衰期较长（T1/2=67.3 h），这使得在对其进行商业推广时遇到了很大障碍[6]。

图3 DTPA-folate的结构

1.2.2111In-DTPA-NOON-Pteroyl 2005 年，Chun Yen Ke等利用氨基乙醚链取代叶酸分子中的谷氨酸残基形成的蝶酸NOON桥与111In-DTPA相连得到111In-DTPA-NOON-Pteroyl。Pteroyl-NOON-DTPA结构如图4所示。111In-DTPA-NOONPteroyl在荷KB细胞肿瘤小鼠体内生物分布情况与111In-DTPA-folate相似，证明去掉叶酸分子中的谷氨酸部分并不会影响叶酸受体的亲和性[7]。

图4 Pteroyl-NOON-DTPA的结构

1.3 99mTc标记的显像剂

1.3.199mTc-DTPA-folate Carla J Mathias等制备得到99mTc-DTPA-folate。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，99mTc-DTPA-folate除了在血液中浓度较高外，其他生物分布与111In-DTPA-folate相仿。但是，由于标记物的放射化学纯度以及稳定性与配体DTPA-folate用量有关，当配体量与111In-DTPA-folate中配体量相当时，其放射化学纯度和稳定性不太理想[8]。

1.3.299mTc-EC20 EC20是含有叶酸结构类似物的肽（如图5所示）。在BALB/c小鼠模型（接种M109肿瘤）中，99mTc-EC20在肿瘤中摄取很高[（17.2±1.02）%ID/g，4 h p.i]，在血液等非靶组织中的清除速度很快，并以原药形式从尿液中排出。其肿瘤摄取以及瘤/血本底比值可以与111In-DTPA-folate相比。目前，99mTc-EC20已用于卵巢癌、宫颈癌和肾癌等的Ⅰ期临床试验，Ⅱ期临床试验也正在进行[9，10]。

图5 99mTc-EC20的结构

1.3.399mTc-HYNIC-folate双功能连接剂HYNIC（肼基烟酰胺）与叶酸分子偶联形成HYNIC-folate（如图6所示）。在共配体tricine/TPPTS的作用下，用99mTc进行标记可得到配合物99mTc-HYNIC-folate。在荷叶酸受体阳性肿瘤24 JK-FBP的小鼠模型中，药物在肿瘤中摄取很高[（17.84±11.43）%ID/g，4 h p.i]，4 h时瘤/血比和瘤/肉比分别为 55±19.2和 28.2±14.8，比111In-DTPA folate和67Ga-DF-folate在KB细胞肿瘤小鼠模型中的瘤/血本底比值低，主要因为24JK-FBP中叶酸受体密度较小所致。但是由于其叶酸受体含量和人体肿瘤中叶酸受体含量近似，所以这种肿瘤模型对研究人体肿瘤更有意义[11]。

图6 99mTc-HYNIC-folate的结构

1.3.499mTc-（CO）3-DTPA-folate中间体[99mTc（CO）3（H2O）3]+与DTPA-folate反应可生成99mTc（CO）3-DTPA-folate。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，肿瘤摄取较高4 h时为（3.3±0.2）%ID/g，靶与非靶比值低于111In-DTPA-folate和99mTc-DTPA-folate，与其他叶酸的螯合物相比，没有发现明显的优越性。但是，为99mTc标记叶酸提供了新的思路[12]。

1.3.599mTc-histidine-folate Cristina Muller等利用链接化学（Click Chemi stry）的方法合成了99mTc-histidine-folate（如图7所示）。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中发现，标记物在肿瘤中摄取较高[（4.29±0.67）%ID/g，4 h p.i]，且滞留时间较长[（3.51±0.37）%ID/g，24 h p.i]，除肾脏外非靶器官摄取很低。4 h荷瘤小鼠SPECT显像，取得较好的显像结果[13]。

图7 99mTc-histidine-folate的结构

1.3.699mTc（X）（tricine/TPPTS） 陆洁等对叶酸分子进行结构修饰后与双功能连接剂HYNIC相连，在tricine/TPPTS存在情况下，进行99mTc标记，得到一系列配合物，如99mTc（HYNIC-NHHNFA）（tricine/TPPTS）和99mTc（HYNIC-lys-pteroyl）（tricine/TPPTS）。HYNIC-NHHN-FA与HYNIC-lys-pteroyl结构如图8、9所示。体外细胞结合实验显示，两种配合物与叶酸受体有较好的亲和力。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，两种配合物在肿瘤中摄取很高，99mTc（HYNIC-NHHN-FA）（tricine/TPPTS）注射后 4 h 最高为 （9.79±1.6）%ID/g，99mTc-（HYNIC-lys-pteroyl）（tricine/TPPT S），2 h最高为（9.60±1.46）%ID/g。两者除了肾脏特异性摄取较高外，腹部其他脏器摄取很低并且清除很快，有很高的靶与非靶比值。99mTc（HYNIC-lys-pteroy）l（tricine/TPPTS） 在荷瘤小鼠SPECT显像中，能够清晰显示肿瘤位置[14，15]。

图8 HYNIC-NHHN-FA的结构

图9 HYNIC-lys-pteroyl的结构

1.4 18F标记的显像剂

1.4.118F-FBA-folate 2006年，Andrea Bettio等标记得到18F-FBA-folate（α）和18F-FBA-folate（γ），结构如图 10、11 所示。两种化合物的IC50（半抑制率）分别为（71±8）nmol/L和（62±6）nmol/L，与叶酸（IC50为41 nmol/L）相比，两种标记物对叶酸受体的亲和力相近。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，注射后125 min18F-α/γ-FBA-folate 在肿瘤中的摄取为（6.56±1.80）%ID/g，肾脏、胆汁、尿液和粪便中有很高的摄取，肾脏为（40.65±12.81）%ID/g，胆汁为（265.80±164.13）%ID/g，尿液为（130.71±92.52）%ID/g，粪便为（29.54±19.98）%ID/g。在荷瘤小鼠 PET 显像中，肿瘤显像清晰，但是由于腹部摄取过高影响进一步推广[16]。

1.4.218F-click-folate 2008年，Tobias L Ross等将Click化学合成方法应用于18F标记过程，得到18F-click-folate，结构如图12所示。整个标记过程大约需要90 min，放化产率最高可达35%。体外细胞结合实验测得标记物Ki（抑制常数）为（9.76±3.13）nM，高于叶酸的（0.61±0.19）nM。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，肿瘤摄取较低[（3.13±0.83）%ID/g，45 min p.i]，主要是由于此标记物脂溶性很强，主要通过肝胆代谢，胆汁、粪便和尿液摄取很高，45 min 时分别为 （667.36±530.09）%ID/g，（56.00±27.64）%ID/g和（49.92±15.58）%ID/g。与18F-FBA-folate的相同点是，在荷瘤小鼠体内PET显像中，此偶联物可以在叶酸受体高表达的肿瘤部分显示出特异性摄取，但是同样由于腹部摄取过高影响显像效果[17]。

图10 18F-FBA-folate（α）的结构

图11 18F-FBA-folate（γ）的结构

图12 18F-click-folate的结构

1.4.318F-FFA 继18F-FBA-folate和18F-click-folate后，Tobias L Ross团队又将18F标记到叶酸分子上，得到18F-FFA（如图13所示），整个标记过程大约需要80 min，衰变矫正后最高产率为4%。体外结合实验测得该标记物Ki为（1.8±0.1）nM，与叶酸分子的Ki[（0.6±0.2）nM]接近。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，肿瘤摄取较高[（9.37±1.76）%ID/g，75 min p.i]。由于亲水性增强，18F-FFA较18F-FBA-folate和18F-click-folate在胆汁、小肠、粪便等腹部非靶器官中的摄取大大降低，主要通过肾脏（尿）代谢。在PET显像中，18F-FFA能清楚显示肿瘤和肾脏的位置。为了降低肾脏摄取，笔者提前注射培美曲塞，75 min后从（35.73±0.25）%ID/g 降至（14.05±1.02）%ID/g，同时肿瘤的摄取变化不大，由（11.50±0.28）%ID/g降至（8.65±3.05）%ID/g[18]。

图13 18F-FFA的结构

1.4.418F-Deoxy-Glucose-folate 2012年，Cindy R Fischer等将葡萄糖实体引入标记物分子中（如图14所示），这样的设计大大提高了标记物的水溶性（logD7.4=-4.2±0.1），但是标记过程较为复杂，耗时大约3 h，校正后产率最高可达25%，放射化学纯度大于95%。体外细胞结合实验中，此标记物对叶酸受体显示出很好的亲和力。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，18F-Deoxy-Glucose-folate表现出很高的肿瘤摄取[（10.03±1.12）%ID/g，60 min p.i]，并且滞留时间较长[（9.05±2.12）%ID/g，90 min p.i]。非靶器官摄取很低，90 min瘤/肝比、瘤/肾比和瘤/肉比分别为 1.28±0.22、0.34±0.07 和 36.09±15.37。与99mTc-EC20 相比，18F-Deoxy-Glucose-folate有相似的生物分布。与其他文献报道肝脏、粪便、胆汁等腹部非靶器官中的非特异摄取，在荷瘤小鼠PET显像中取得了很好的显像结果[19]。

图14 18F-Deoxy-Glucose-folate的结构

1.4.5 2-[18F]-fluoropyridine-4-carbohydrazide-folate I Al Jammaz等标记得到2-[18F]-fluoropyridine-4-carbohydrazide-folate（如图15所示），整个标记过程大约45 min，放化产率大于80%，放射化学纯度大于97%。在体外细胞结合实验中，此标记物显示出对叶酸受体较强的亲和力，解离常数Kd为（15.51±1.80）nM。在荷KB细胞肿瘤小鼠模型中，肿瘤摄取虽然不是很高[（5.74±0.16）%ID/g，60 min p.i]，但是除了肾脏特异性摄取较高外，非靶器官摄取很低（均小于1.00%ID/g），在荷瘤小鼠micro PET显像中取得了很好的显像结果[20，21]。

图15 2-[18F]-fluoropyridine-4-carbohydrazide-folate的结构

2 结语

近年来，受体介导的靶向分子探针成为放射性药物研发的重点。与其他靶向转运系统相比，叶酸受体具有亲和力强、分子量小、价格低廉、易于结构修饰、化学和生物稳定性好、无免疫原性等优点，叶酸及其类似物偶联的叶酸受体药物成为靶向药物研究的热点。目前，大多数叶酸受体介导的放射性药物的研究仅限于实验阶段，而寻找更好的标记方法、更优的连接剂，提高药物体内靶向性是今后需要解决的问题。

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