刘欣 李志英 刘瑞瑞 李璐璐 王卫卫

摘 要：为了解大豆根际细菌群落结构多样性及根际细菌群落结构的变化，该研究以大豆苗期和成熟期的根际土壤为材料，采用Illumina高通量测序技术测定细菌16S rRNA V3+V4区序列，探究大豆不同生育期根际土壤细菌群落结构的变化。对原始数据进行拼接、过滤、去除嵌合体序列和聚类分析等数据处理，并对OTU进行分类学注释。在此基础上运用ANOVA分析物种组成变化，Alpha多样性指数研究细菌多样性变化。结果表明：细菌丰富度和多样性在不同生育期有显著变化，其中成熟期土壤中的细菌丰富度和多样性指数均明显高于苗期;变形菌、放线菌、酸杆菌是大豆根际的优势菌门，其含量在不同生育期也有显著变化;假诺卡氏菌属、糖丝菌属、鞘氨醇单胞菌属是大豆根际的优势菌属，这些菌属中的部分菌群属于根际促生菌，具有潜在的促生效应。这些结果证实大豆的生育期对根际土壤细菌群落结构有重要影响。

关键词：生育期，大豆，根际土壤，细菌群落，Illumina 高通量测序

中图分类号：Q948.15

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）10-1363-08

Abstract：Soybean rhizosphere soils at seedling and mature stages were collected in this experiment as the research material，and Illumina high-throughput sequencing technology was used to determine the 16S rDNA V3+V4 region sequence of bacteria，in order to understand the diversity of bacterial community structure and the changes of bacterial community structure in soybean rhizosphere.

The original Tags data were used by splicing，filtering，removal of chimeric sequences and cluster analysis of data processing，OTU taxonomic annotation. On this basis，the changes of species composition were analyzed by ANOVA method，and the diversity of bacterial composition was also studied by alpha diversity index. The results showed that there was a significant change in the abundance and diversity of bacteria at different growth stages. Diversity index analysis showed that the abundance and diversity at mature stage was significantly higher than seedling stage in soybean rhizosphere soil. Species composition analysis results showed that Proteobacteria，Actinobacteria and Acidobacteria are the dominant rhizosphere bacteria at phylum level and their contents in different growth stages also significantly increased. ANOVA analysis showed that the abundances of Proteobacteria and Acidobacteria were significantly different，but Actinobacteria was not significantly different at different growth stages. Pseudonocardia，Saccharomyces and Sphingomonas were the dominant genra in the rhizosphere of soybean. Some of these genera belonged to plant growth-promoting rhizobcteria and had the potential capacity for promoting growth. These results confirm that the growth period of soybean has an important influence on the bacterial community structure in rhizosphere soil.

Key words：growth stage，soybean，rhizosphere soil，bacterial flora，Illumina high-throughput sequencing

大豆是一種重要的农作物，在世界范围内都有广泛的种植。它在很多领域（食品、畜禽养殖饲料等）都有广泛的应用，是我国的主要粮食和重要的油料作物（Susser & Uzzell，1991;李亮等，2016;陈允正等，2011）。大豆是我国的传统作物，其种植面积位于水稻、小麦、玉米之后，占我国粮食播种面积的8%～10%（蒋秋林，2010）。目前我国对大豆的需求量大幅上升，自给率持续走低，主要依靠进口大豆来维持需求（毕影东等，2014;张振华和刘志民，2009）。因此，越来越多人开始研究如何提高大豆产量，以供应国内大豆的需求。

根际土壤是指处于植物根际周围受根系生长直接影响的土壤，根际微生物是受植物影响最大的土壤微生物群体，与植物的生长发育关系密切（陈文新等，2003）。根际微生物群落结构的变化对土壤中物质和能量的循环、有机质的分解与合成等方面有重要影响（Preston et al，2002;徐文静等，2014）。影响根际微生物群落结构变化因素有很多，不同植物间、同一植物的不同基因型，甚至同一植物的不同生育期其根际微生物的数量、种类都有很大差别（Marschner et al，2001）。根际分泌物为根际微生物的生长提供营养和能源物质，其对微生物的数量、种类、分布及微生物的生长都有一定的影响（张淑香和高子勤，2000）。植物生长又与根际微生物息息相关，根际微生物的生理活动对土壤性状、植物养分吸收、植物的生长发育都有明显的影响;根际微生物的种群与植株的健康状况有关，很大程度上决定作物的产量与品质（胡小加，1999）。有些根际微生物可以产生激素类物质促进土壤有机质分解、诱导植株增加抗性等，或者通过争夺营养和占领生态位等方式抑制病原菌的生长来间接促进植物的生长（周文杰等，2016）。根际微生物群落结构失调可能会导致病原菌数量的增加，从而使作物减产。目前，有关于大豆与根际微生物相互作用的研究大多集中于大豆根际与根瘤菌和丛枝菌根真菌的共生关系（Jie et al，2013; Denison & Kiers，2011）。然而，根际土壤微生物种类繁多，各种微生物的相互作用可能影响大豆与根瘤菌和丛枝菌根真菌的相互作用。大豆在生长过程中与根际微生物相互作用的机制仍不明确。Xu et al（2009）利用DGGE研究大豆根际微生物表明，放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门的相对丰度随着大豆生育期的变化而变化。因此，了解不同生育期大豆根际细菌群落结构的变化，对评价生育期对土壤微生物多样性的影响具有重要意义。

一直以来由于大多数微生物在营养培养基中可培养性低或不能被培养的缺陷严重制约了微生物多样性的研究（Kamagata & Tamaki，2005）。随着分子生态学研究技术的发展，以DNA为基础的分子分析技术，如PCR-RFLP、DGGE/TGGE、SSCPP等可以克服传统培养技术的限制，从分子水平来直接分析微生物群落结构的变化，但这些技术存在检测限低，工作量大，灵敏度低等缺陷（You et al，2014）。相对于以上研究手段，高通量测序技术具有速度快，耗时少，成本低廉，准确度高等优点，能更真实地反应环境中群落的特点。目前，高通量测序技术主要是Illumina、Roche454 和Life Technologies 等公司开发的测序平台（楼骏等，2014）。Illumina HiSeq 2500 在一个运行周期7 d的时间里可以产出600 G的数据量，具有数据通量高，准确率高，成本可控等优点（Quail et al，2012）。

本研究以大豆为材料，采集大豆苗期和成熟期的根际土样。运用Illumina测序平台对土壤样品16S rDNA进行了高通量测序技术，探究两个不同生育期的大豆根际土壤细菌群落结构多样性及变化，这对评价生育期对土壤微生物多样性的影响具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

所用土壤样本采集于陕西省咸阳市（107°38′ E，34°11′ N，暖温带大陆性季风气候，年平均气温13.4 ℃，降水量519.2 mm，日照时数2 175 h）大豆大田。采用“S形采样法”在大豆田中选择5个采样点，按照Riley & Barber（1969）的抖落法，用无菌小刷子刷取粘着于植物根上的土壤，5个植株的土壤合为一个样本，最终将采集完成的样本过2.0 mm筛，混合均匀分为3份，放置于-20 ℃冰箱中保存。样品采自苗期（2016年6月24日），样品编号为DWA;成熟期（2016年9月30日），样品编号为DYA，共6个样本（2个时期，3个重复）。

1.2 土壤总DNA的提取与电泳检测

使用PowerSoilDNA Isolation Kit（MoBio，美国）提取土壤总DNA，经琼脂糖凝胶电泳定性检测后，再采用核酸定量分光光度计（NanoDrop，美国）测定浓度后置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 16S rRNA V3+V4区的 PCR 扩增及测序

以提取的总DNA作为模板，以338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）为引物（Zhang et al，2015），对细菌的16S rRNA V3+V4区进行扩增。PCR反应体系共50 μL：基因組DNA 40-60 ng，*Vn F（10 μmol·L-1） 1.5 μL，*Vn R（10 μmol·L-1） 1.5 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL，High GC Enhancer 10 μL，Bμffer 10 μL，dNTP 1 μL，ddH2O 补至总体系50 μL。反应程序为95 ℃预变性5 min，进行15次循环（95 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min），72 ℃最终延伸7 min。对PCR产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，对建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500平台进行测序，PCR 扩增及测序工作由北京百迈客公司完成。

1.4 数据分析

测序完成后，使用FLASH v1.2.7软件，通过overlap对每个样品的测序片段进行拼接，得到的拼接序列即原始数据;使用 Trimmomatic v0.33软件，对原始数据进行过滤，得到高质量的过滤后数据;使用 Uchime v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用QIIME（version 1.8.0）软件中的 Uclust对序列按 97%的相似度水平下进行聚类，获得样品的OTU分类数据，并基于Silva（细菌）分类学数据库对OTU进行分类注释。

2 结果与分析

2.1 样品序列数特点

对各样本细菌的16S rRNA V3+V4区测序，经数据前处理，最终得到的测序长度集中在 280～460 bp之间，且2个样品共产生1 919个OTU。各样本统计结果见表1。从样本中随机抽取一定数量的序列，统计这些序列所代表的物种数目，并以序列数与物种数来绘制稀释性曲线，如图1示。随着测序条数的增加，曲线逐渐趋于平缓，说明测序深度已经足够。

2.2物种组成分析

物种组成分析反映样品在不同分类学水平上的群落结构。图2：a和图2：b分别展示门（phylum）水平和属（genus）水平的群落结构和分类比较结果，相对含量前十的菌门是放線菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、浮霉菌门（Planctomycetes）、装甲菌门（Armatimonadetes）。在属水平，优势属主要有变形菌门的Sphingomonas、H16、Phaselicystis、haliangium，酸杆菌门的RB41、Bryobacter，放线菌门的Pseudonocardia、Saccharothrix、Nocardioides，还有相对丰度较高的未分类菌属。不同生育期的土样中细菌的菌群分布有差异，其中在样品DYA中变形菌门、芽单胞菌门的丰度有所下降，其他菌门的丰度都有不同比例的上升。从属水平上，相较于DWA，样品DYA中Sphingomonas、Pseudonocardia的丰度有明显的下降，而RB41的含量明显上升。

分别对样品在门分类水平和属分类水平进行ANOVA分析，发现在门水平上丰度排名前十的门中除放线菌门，浮霉菌门，装甲菌门外，其他菌门都存在显著差异，其中变形菌门的差异极显著（P=0.000 81）;在属分类水平上，差异显著的属注释到Pseudonocardia（P=0.000 839）、Phaselicystis（P=0.000 144）、Saccharothrix（P=0.000 404）、RB41（P=0.001 633）、Nocardioides （P=0.011 744），其中差异最为显著的属为Phaselicystis。

2.3 细菌群落多样性分析

两个样品的Alpha多样性指数，包括Shannon、Simpson、Ace、Chao1 4个指数如表4所示。表4结果显示，Shannon DYA>DWA，Simpson DYA2.4 NMDS分析结果

NMDS（nonmetric multidimensional scaling）分析，即非线性多维标度分析，常用于比对样本组之间的差异。对所有样品进行NMDS分析，如图3所示，样品点的分布代表样品间相似的程度，从图中可以看出样品DYA与DWA明显位于不同的象限内，说明两个样品间相似度不高。

3 讨论与结论

细菌是土壤微生物中的重要组成部分，其种类、数量对土壤的生物化学性质及土壤养分有直接影响。Illumina高通量测序技术具有快速、方便、准确性高等特性，而广泛应用于土壤微生物多样性的研究。本研究通过此方法分析大豆两个不同生育期根际土壤中细菌的群落结构及多样性。经该方法得到的结果显示各个样本的覆盖率均在99%以上，证明本次测序结果能够反应样本的真实情况。

本研究发现，所有样品中共含有25个细菌门。其中变形菌、酸杆菌、放线菌3大门类的相对丰度最高。袁红朝等（2015）分析了稻田土壤细菌的群落结构，发现变形菌、酸杆菌和绿弯菌是稻田土壤优势细菌，其次是放线菌。Jangid et al（2008）研究发现变形菌在不同类型的耕作土壤中都是绝对优势菌属，其次是酸杆菌。杨菁等（2015）对降香黄檀不同混交林土壤细菌多样性研究发现，土壤中主要菌群有变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门。牛世全等（2017）分析了河西走廊地区盐碱土壤群落结构，发现变形菌门含量最高，占28.56%;其次是放线菌门，占17.2%;拟杆菌门占12.3%。本研究发现，在大豆根际土壤中变形菌门的含量最高，其次是酸杆菌门，放线菌门，而绿弯菌门的含量较少，这可能于地理因素引起的生态多样性、土壤营养情况和作物种类有关。本研究中，相对丰度较高的菌属有：Sphingomonas、H16、Phaselicystis、Haliangium、RB41、Bryobacter、Pseudonocardia、Saccharothrix、Nocardioides。假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）属于放线菌门，该属微生物在产生抗生素和维生素降解方面有重要作用（Carr et al，2012; Cuesta et al，2013），此外还发现该属的某些菌株还能产生维生素、酶类等重要的生物活性物质（吕志堂和刘志恒，1999）。糖丝菌属（Saccharothrix）属于放线菌门，该属的微生物在纤维素降解和生物防治方面有重要的作用，王丽娟等（2007）研究表明橘色糖丝菌对大豆种传病原真菌有良好的防治效果。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）属于变形菌门，该属微生物在降解复杂有机物方面有重要的作用（胡杰等，2007），另外还发现该属的某些微生物能分泌吲哚-3-乙酸促进植物生长（Tsavkelova et al，2007），但该属也包括一些致病菌，如鞘氨醇单枯病（Buonaurio et al，2002）。我们发现大豆根际菌群的丰度在不同生育期有一定的变化。这可能是由于大豆在生长过程中根际分泌物发生了变化，有报道称在拟南芥的生长过程中根际微生物的变化与根际分泌物有关（Chaparro et al，2013）。

Alpha多样性可以反映单个样品内部的物种多样性，Chao1和Ace指数简单地反映出群落中物种的数量，而不表示群落中每个物种的丰度信息。Shannon和Simpson指数用于衡量群落多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度的影响，Chao1、Ace、Shannon指数值越大，Simpson指数值越小说明样品的物种多样性越高。本研究结果表明：Chao1和Ace指数显示DWA>DYA，Shannon指数显示DWADYA，Chao1 指数在所有样品间的趋势与加入了均匀度影响的Simpson指数不同。Haegeman et al（2013）指出，Chao1指数在计算时加入了低丰度序列，会引起多样性的低估，且这种低估会随菌群物种数的增加而加大，这可能是本研究中采用不同多樣性指数得到不一致结果的主要原因。NMDS即非度量多维标定法，用于比较样本的组内或组间差异。NMDS是非线性模型，能更好的反应样本间的差异，其效果优于PCA/PCoA等线性模型。本研究中Stress=0.000 0，表明NMDS分析可靠性高。结果显示样品DWA与DYA明显位于不同的象限内，说明两个样本间相似性不高，即生育期不同根际细菌的群落结构有一定的差异。有大量研究证实根际微生物的数量和群落结构会随生育期的不同而发生改变。Duineveld et al（2001）对菊花根际微生物研究发现，幼龄植株与成熟植株根际土壤微生物群落结构差异较大。Farina et al（2011）研究发现，油菜根际微生物群落结构因生育期不同而不同，莲座期的丰度最高。张健（2014）运用DGGE技术对大豆根际细菌群落结构进行研究发现，盛花期的细菌多样性高于成熟期。Xu et al（2009）依据DGGE图谱发现，大豆根际细菌多样性呈现先增加后降低的趋势，从初花期开始增加，到鼓粒期达到最大，成熟期最低。本研究发现大豆生育后期的微生物多样性高于生育前期，与张健（2014）、Xu et al（2009）结果不一样可能与DGGE技术本身的缺陷有关，该技术仅能分析优势的微生物菌群，且检测限低，随机性大，可能低估微生物群落大小和多样性;另外与作物品种、土壤营养状况、地理环境因子等因素相关。

本研究运用高通量测序技术探究两个不同生育期大豆根际土壤中细菌群落结构变化。通过对大豆两个生育期根际土壤分析可知，成熟期土壤的多样性指数高于苗期根际土壤，这表明大豆的生育期对根际土壤细菌群落结构有重要影响。本研究为了解大豆根际细菌群落结构多样性及根际细菌群落结构的变化提供理论依据。