王晓娇，曹春梅，逯春杏，许 飞，刘秉琦

（1.内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010018）

马铃薯黑痣病是一种以带病种薯和土壤传播的真菌性病害，由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起，主要危害马铃薯幼芽、茎基部及块茎，会造成马铃薯缺苗断垄，发病严重时将导致植株死亡[1]，收获后薯块商品性大大降低。近几年来，随着中国马铃薯种植效益的不断提高，种植面积随之不断扩大，许多马铃薯种植区出现倒茬困难，重迎茬问题普遍发生，不同地区之间种薯调用频繁，导致马铃薯黑痣病发生逐年加重[2,3]。据曹春梅等[4]调研，在内蒙古马铃薯种植区，一般田块马铃薯黑痣病发病率在5%～10%，重症田块发病率可达到70%～80%，收获后薯块带菌率最高可达100%。目前，马铃薯黑痣病己成为内蒙古地区马铃薯产业发展的一大障碍，严重影响着马铃薯的产量和质量，阻碍了薯业健康快速发展，同时大大挫伤了广大农民种植户种植马铃薯的积极性[5]。马铃薯黑痣病在化学药剂防治方面已经有了新突破，在一定程度上可以预防和控制黑痣病的大面积发生，但在实际生产中如何根据环境变化来提前有效预防病害发生，减少农药的使用量，降低生产成本，还没有相关报道，这就需要对适合病原菌生存发展的环境具有一定的把控。本试验研究内蒙古不同地区病原菌（菌核）的萌发、萌发能力的丧失和地下侵染能力与环境的关系，为马铃薯黑痣病病害系统治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株的分离与鉴定

从内蒙古集宁区、武川县、达茂旗、四子王旗、商都县、固阳马铃薯种植区，调查采集马铃薯黑痣病的罹病标本（病茎或病薯）带回实验室，采用常规的组织分离法，进行分离。用解剖刀取病斑边缘3～5 mm的小块或是薯块上的小黑点，先后放入75%的酒精和0.1%升汞中进行表面消毒，然后再用灭好菌的纯净水冲洗2～3次，放到吸水纸上吸干表面水分，再放入固体PDA平板上，每个平板上可放置2～3个，并放于25℃下的恒温培养箱中培养48～72 h。如有菌丝长出，在无菌条件下，用牙签将尖端菌丝移入另一固体PDA平板上进行纯化培养，将分离好的认为是马铃薯立枯丝核菌的菌株进行镜检、形态学鉴定和致病性测定，最终确认为病原菌，保存在4℃的PDA培养基上，备用。

1.2 不同温度对病原菌萌发的影响

将选取的菌株（表1）接种到PDA培养基上进行活化，活化后用打孔器打出直径为5 mm的待测菌株菌饼，再接种到直径为90 mm的PDA培养基平板正中央，每个菌株3次重复，共270（6个地点×每个地点3个菌株×3次重复×5个温度）皿，分别放置在5，15，25，30和35℃的光照培养箱中黑暗培养，观察测量病原菌的生长情况，用十字交叉法每天测量每个菌株生长直径。

表1 黑痣病菌株编号及其采集地点Table 1 Rhizoctonia solani strains isolated from potatoes in different cites

1.3 不同温度对菌核萌发的影响

将从集宁区、武川县、固阳、达茂旗、四子王旗和商都县6个地区采集的60个（每个地区10个菌株）黑痣病菌株进行活化，接种到PDA培养基中，每个菌株活化10皿，培养50 d后，每个培养皿中取出15个形成的菌核，合计每个地区共取出1 500个菌核。在每个培养皿中放入2张用无菌水浸湿的滤纸，浸湿程度以倒置不滴水为宜，将以上准备好的各地区供试菌核，放置到培养皿中，每个培养皿均匀放置100个菌核，分别放置在5，15，25，30和35℃的恒温培养箱中黑暗培养，每个地区、每个温度3次重复，定期观察每个培养皿中菌核的萌发情况，观察时可采用放大镜，用镊子取出已经萌发的菌核，不间断的观察7 d，计算出萌发率。

1.4 不同埋藏深度对菌核萌发的影响

将从集宁区、武川县、固阳、达茂旗、四子王旗和商都县6个地区采集的60个（每个地区10个菌株）黑痣病菌株进行活化，接种到PDA培养基中，每个菌株活化3皿，培养50 d后，在每个培养皿中取出5个菌核，将取出的菌核混匀后装入纱袋中（纱袋大小约15 cm×20 cm），每袋装入约大小一致的菌核100个。在内蒙古农牧业科学院试验地内，设置菌核位于泥土表层下5，10和15 cm 3个处理深度，重复3次，于5月15日埋藏，埋藏10，15，20，25和30 d观察菌核萌发情况，每观察一次取出已萌发菌丝的菌核，可采用放大镜进行观察，用镊子取出已经萌发的菌核，没有萌发的菌核再次埋藏，统计累计萌发率。

1.5 不同地区对地下埋藏菌核萌发的影响

将从集宁区、武川县、固阳、达茂旗、四子王旗和商都县6个地区采集的60个（每个地区10个菌株）黑痣病菌株进行活化，接种到PDA培养基中，每个菌株活化3皿，培养50 d后，在每个培养皿中取出10个菌核，将取出的菌核混匀后，装入纱袋中，每袋装入约大小一致的菌核100个。在内蒙古农牧业科学院试验地、武川县、固阳县、达茂旗、四子王旗和商都县，设置菌核位于泥土表层下15 cm深度，重复3次，于5月20日埋藏，埋藏30 d后，观察菌核萌发情况，统计萌发率。

1.6 菌核的多次萌发试验

将从集宁区、武川县、固阳、达茂旗、四子王旗和商都县6个地区采集的60个（每个地区10个菌株）黑痣病菌株进行活化，接种到PDA培养基中，每个菌株活化1皿，培养50 d后，在每个培养皿中取出5个菌核，合计共取出300个菌核进行试验，将菌核混匀后置于含2层潮湿滤纸的培养皿中，倒置不滴水为宜，每皿50粒，放置6皿，将培养皿放到恒温培养箱中黑暗培养，培养温度为25℃，观察培养皿中菌核的萌发情况，16～20 h观察一次，用镊子取出已经萌发出菌丝的菌核，将萌发的菌核再晾干保存，连续观察3 d后，统计并计算出萌发率。再将萌发后晾干的菌核进行2次萌发，按照相同做法，再进行第3次和第4次萌发，统计并计算出每次的萌发率。

1.7 菌株地下侵染能力试验

本试验采用土壤拌菌法，土壤∶蛭石按3∶1比例均匀搅拌后再将来自集宁区、武川县、固阳、达茂旗、四子王旗和商都县6个地区的菌株以1/5皿的量接种到每个塑料桶中（塑料桶体积为30 cm×50 cm），每个地区选取3个菌株，每个菌株3次重复，接种54桶，种薯品种选用‘克新1号’原原种，种薯用0.5%的高锰酸钾消毒10 min，播种深度为10 cm，每盆5块种薯，塑料桶随机排列，定期定量加水调节土壤湿度，播种120 d后，调查每株马铃薯植株的发病情况，在整个试验过程中，除了土壤中菌种不同外，其他生长条件均保持一致。

2 结果与分析

2.1 温度对病原菌萌发的影响

图1 病原菌生长速度与温度的关系Figure 1 Relation between pathogen growth rate and temperature

由图1可以看出，不同地区的病原菌在5及5℃以上均可以萌发生长，但温度较低时生长较慢；从生长起始温度看，各地区病原菌无显著差异，随着温度的升高，各地区病原菌生长速度均是上升的趋势；同一温度下不同地区病原菌生长速度出现显著性差异，25℃时，固阳病原菌生长速度最快3.33 mm/h，其次为达茂旗2.92 mm/h，集宁区2.85 mm/h，温度30℃时，固阳病原菌生长速度2.63 mm/h，集宁区2.36 mm/h，达茂旗2.24 mm/h，显著高于其他3个地区，初步说明固阳、集宁区、达茂旗病原菌生长能力高于其他3个地区，温度达到35℃病原菌生长速度降低，但仍处于生长状态。从试验数据总体看，各地区病原菌在5～35℃均可以生长，适应温度范围较大，最适宜生长温度为25～30℃。

2.2 温度与菌核萌发的关系

图2为培养24 h后调查各地区病原菌不同温度下的萌发情况，从图2可以看出，不同地区菌核的萌发起始温度不同，在5℃下，武川区和固阳区菌核萌发率已较高，分别为43.44%、38.33%，显著高于其他地区；随着温度的升高，各地区菌核萌发率升高，且萌发速度较快，24 h内达茂旗菌核萌发率达到100%。不同地区菌核在同一温度下萌发率不同，在25℃下，固阳区萌发率95%，集宁区为65.67%，差异显著。从图2中还可看出，各地区菌核最适宜萌发温度为30℃；图3为培养48 h后调查各地区病原菌不同温度下的萌发情况，从图3可以看出，随着培养时间的延长，在不同温度下，不同地区的菌核均可以萌发，萌发率达到96%以上。从试验结果看，不同温度下，不同地区菌核萌发速度不同，但长时间内，各地区菌核均可以萌发生长。

图2 24 h调查菌核萌发情况Figure 2 Sclerotium germination in 24 h

图3 48 h调查菌核萌发情况Figure 3 Sclerotium germination in 48 h

图4 埋藏深度与菌核萌发的关系Figure 4 Relation between buried depth and sclerotium germination

2.3 埋藏深度与菌核萌发的关系

从图4可以看出，菌核在不同深度的埋藏下，在埋藏10～20 d，不同埋藏下菌核萌发速度、萌发率上存在显著差异；埋藏深度10～15 cm，更适合菌核的萌发，可能的原因为埋藏5 cm深度离地表较浅，土壤湿度出现上下波动，而影响菌核的萌发；随时间的延长，埋藏30 d，不同深度的菌核均全部萌发，说明不同土壤深度影响菌核的萌发，但时间足够长，环境稳定不同深度菌核也会全部萌发。

2.4 不同地区与菌核萌发的关系

埋藏30 d后，将埋藏在内蒙古农牧业科学院试验地、武川县、固阳、达茂旗、四子王旗和商都县6个地区装有菌核的纱袋全部取出，用扩大镜进行观察。试验数据显示，不同地区埋藏的菌核均萌发，萌发率为100%，如图5所示。

由试验可知，内蒙古的各地区土壤环境均适宜病原菌的萌发。

2.5 菌核多次萌发的特性

表2试验结果显示，菌核第1次萌发率为98.00%，第2次萌发率为66.55%，第3次萌发率46.32%，第4次萌发率为31.76%。由此可以看出，立枯丝核菌菌核具有多次萌发的特性，但随着萌发次数的增多，萌发率逐渐递减。这也可以说明马铃薯黑痣病病原菌的菌核可在地下存活多年，并具有一定的萌发能力，从试验结果来看，菌核具有这种多次萌发的特性，可能是一种对自身的保护性机制，在土壤中可以延长其存活时间，保存其活力，使菌株存活和再生。

图5 菌核萌发Figure 5 Sclerotium germination

表2 菌核萌发率Table 2 Sclerotium germination rate

表3 不同地区病原菌地下侵染块茎致病率Table 3 Pathogenesis rate of different region's sclerotium

2.6 菌株的地下侵染能力

表3结果显示，不同地区病原菌，在适宜的环境下，均能萌发侵染致病，且致病率较高，致病率为84.85%～97.73%，说明内蒙古各地区马铃薯黑痣病立枯丝核菌病原菌对马铃薯的侵染致病能力较强，应提前预防和防治马铃薯黑痣病的发生。

3 讨 论

不同地区的马铃薯黑痣病立枯丝核菌的萌发与温度有很大关系，在5℃及高于5℃开始萌发，最适宜萌发温度25～30℃，与李清铣和夏正俊[6]的研究结果较一致，不同来源的R.solani菌丝可在15～35℃正常生长，最适宜的生长温度为25℃。内蒙古各地区病原菌在同一温度下萌发速度不同，侵染能力不同，所以不同地区应在不同时间或温度环境下采取不同防治措施，当土壤温度达到15℃以上，且湿度适宜，内蒙古各地区均应开始预防马铃薯黑痣病的发生。目前研究发现，马铃薯黑痣病的发生迟早决定于当年的温度和土壤湿度的相关性还有待继续研究，了解不同地区马铃薯黑痣病病原菌的萌发情况，对当地种植者测报和防治黑痣病的发生具有重要意义。

黑痣病病原菌的菌核在不同地区，不同土壤深度，不同生态条件下均能萌发侵染，说明其生命力相当顽强，内蒙古各地区应加强对马铃薯黑痣病的预防。

研究者发现，马铃薯黑痣病病原菌的菌丝体在土壤中植株残体上越冬，病原菌的菌核在块茎上或土壤中过冬[7,8]，这些菌核或菌丝体是翌年侵染的侵染源[9]，病菌可在土壤中存活2～3年[10]。本试验中发现，内蒙古不同地区的菌核均具有多次萌发和地下侵染能力，经过4次萌发，菌核仍具有一定的萌发力，说明菌核可在地下存活多年，对前人的研究进行了补充，这也指导马铃薯生产者在生产过程中应轮作倒茬4年以上才可减少马铃薯黑痣病的发生。研究还发现，内蒙古不同地区的病原菌对马铃薯都具有较强的侵染力，且病原菌菌核萌发初次侵染寄主后，可以随雨水、地下水进行漂流，再引起多次侵染，这样对黑痣病病害水平的扩展将起着非常重要的作用。

马铃薯黑痣病立枯丝核菌的这些特性给种植户在有效防治上带来了更多复杂而严峻的问题。到目前为止还没有发现对黑痣病有高抗或者免疫的马铃薯品种，因此对马铃薯黑痣病的防治也只能根据每年病害的流行发生规律和病菌自身的生态学特点，结合多种方法、措施进行全方面的综合防治。通过本试验的研究，掌握了内蒙古部分地区马铃薯黑痣病发病情况及与温度的相关性，在实际生产和预防马铃薯黑痣病发生上具有重要指导意义，但对于黑痣病病原菌的萌发和湿度及温湿度两者共同的综合作用关系还不是很清楚，需要继续进行研究发现。

[参考文献]

[1]曹春梅,李文刚,张建平,等.马铃薯黑痣病的研究现状[J].中国马铃薯,2009,23(2):171-173.

[2]邱广伟.马铃薯黑痣病的发生与防治[J].粮食作物,2009(6):133-134.

[3]常来,王文桥,朱杰华.北方一季作区马铃薯黑痣病的发生及防控策略[J].安徽农业通报,2010,16(7):116-117.

[4]曹春梅,张智芳,李文刚,等.新型杀菌剂对马铃薯黑痣病病菌的室内毒力测定和田间效果分析[J].中国马铃薯,2011,25(4):246-250.

[5]田晓燕,蒙美莲,胡俊,等.马铃薯黑痣病菌菌丝融合群的鉴定[J].中国马铃薯,2011,23(5):171-173.

[6]李清铣,夏正俊.江苏几种作物病原丝核菌生物学特性的研究[J].江苏农学院学报,1988,9(3):23-26.

[7]李乾坤,孙顺娣,李敏权.马铃薯立枯丝核菌的研究[J].马铃薯杂志,1998,2(2):79-84.

[8]谭宗九,郝淑芝.马铃薯丝核菌溃疡病及其防治[J].中国马铃薯,2007,21(2):108-109.

[9]Banville G J.Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kühn[J].American Potato Journal,1989,66:821-834.

[10]Lootsma M,Scholte K.土壤消毒与收获方式对翌年马铃薯Rhizoctonia solani病害发生的影响[J].杂粮作物,1997(2):44-46.