裴慧，王立启，王磊，王维，毕秀萍，才晓君，苏国海，赵卓

内源性雌激素对女性绝经前心血管内环境的稳定起重要的调节作用[1]，能延缓高血压、心力衰竭和冠状动脉疾病的发展。绝经后雌激素替代疗法对心血管疾病具有保护作用[2,3]。最初研究证实，雌激素主要通过经典雌激素受体ERα和ERβ来调控基因的转录进而保护心血管系统[4，5]。随着研究的深入，G蛋白偶联受体30（GPR30）作为雌激素受体的功能被发现[6]，国际药理学联合会（IUPHAR）也将GPR30或G蛋白偶联雌激素受体1（GPER1）分类为膜雌激素受体。

GPER1参与雌激素介导的基因转录和信号通路的调节[7]。GPER1主要通过快速非基因组机制参与雌激素信号的传导，如细胞应答效应中的钙动员、激酶激活及一氧化氮产生等[8]。近年来，特异性GPER1激活剂G1（简称G1）[9]和抑制剂G15（简称G15）的合成，为其药理学和生理学的研究开辟了新途径。研究发现，G1作用于内皮细胞、血管平滑肌细胞和肾素-血管紧张素系统，产生舒张血管[10]、降低血压[11]、抗炎[12]、防止心肌再灌注损伤[13]、缓解肺动脉高压[14]等心血管保护作用。

虽然GPER1具有潜在的心血管保护作用，但其在缓解心肌细胞肥大中的作用机制仍未阐明。本研究通过串联质谱标签（TMT）蛋白质谱技术和生物信息学分析进行大数据分析，通过蛋白免疫印迹法（Western-blot）和荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术探究其可能的调控机制。

1 材料与方法

材料与试剂： G1、G15（Cayman Chemical，美国），DMEM高糖培养基（Hyclone，美国），胎牛血清（Gibico，美国）、马血清（BI，以色列），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、抗GPER1抗体（Abcam，美国），抗丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）抗体、抗p-AKT抗体、抗细胞外调节蛋白激酶（ERK）抗体、抗p-ERK抗体、抗LC3抗体和抗GAPDH抗体（CST，美国），二抗HRP（Proteintech，中国），Alexa Fluor 488抗体（Life Technologies，美国），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DIPI,Thermo Fisher Scientific，美国），qRT-PCR试剂盒（TAKARA，日本）和流式试剂盒（BD，美国）。

细胞培养：2～3日龄的新生Wistar乳鼠50只（购自山东大学动物实验中心）表皮消毒后，摘取心脏并剪碎成2～3 mm3的组织块，胰蛋白酶（0.1%）重悬置于磁力搅拌器消化10 min。5%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，800 g离心10 min后收集细胞。DMEM高糖培养基（含有6%马血清、8%新生牛血清和1%青霉素/链霉素），培养箱中培养细胞24 h。

模型建立和分组：心肌细胞血清饥饿后，AngⅡ（0 、50 、100 和250 nmol/L）诱导心肌细胞肥大。检测信号通路检测实验分为6组：空白对照组、AngⅡ 组、AngⅡ +G1组、AngⅡ +G1+G15组、AngⅡ+G1+ERK抑制剂 （U0126）组和AngⅡ+G1+AKT抑制剂 （MK2206）组。空白对照组不给药；AngⅡ组给予AngⅡ（100 nmol/L）处理；AngⅡ+G1组给予AngⅡ（100 nmol/L）和G1（100 nmol/L）处理；AngⅡ+G1+G15组给予AngⅡ（100 nmol/L）、G1（100 nmol/L）和G15（100 nmol/L）处理；AngⅡ +G1+U0126组 给 予 AngⅡ（100 nmol/L）、G1（100 nmol/L） 和 U0126（100 nmol/L） 处 理；AngⅡ+G1+MK2206组给予AngⅡ（100 nmol/L）、G1（100 nmol/L）和 MK2206（5 μmol/L）处理。各组n=3。

蛋白质谱分析：检测空白对照组、AngⅡ（100 nmol/L）组和AngⅡ+G1（100 nmol/L）组的蛋白表达差异。用软件Mascot2.5和Proteome Discoverer2.1，筛选出差异倍数＞1.2，P＜0.05的差异蛋白分子。

细胞免疫荧光染色：心肌细胞4%多聚甲醛固定20 min，0.5%Triton X-100细胞膜通透剂室温通透20 min，血清封闭。GPER1抗体1:300稀释4℃孵育过夜，PBST（PBS+Tween-20洗液，pH=7.4）浸洗后，荧光二抗避光孵育1 h，DAPI避光孵育10 min，镜下观察采集图像。

Western-blot： 6 孔板加入 100 µl RIPA 裂解液和1%PMSF蛋白酶抑制剂裂解细胞，超声粉碎，4℃12 000 g离心，取上清蛋白定量。25 µl 5 X loading buffer 混匀后100℃水浴，-80℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，90 V恒压电泳，250 mA恒流转膜，5%脱脂奶粉封闭，洗膜，抗体1:1 000稀释4℃孵育过夜。TBST洗液漂洗后，二抗1:1 0000孵育1 h，漂洗后化学发光法显色。

qRT-PCR检测： Trizol法提取总RNA后，按Takara试剂盒说明书要求行cDNA逆转录。所有引物购自Takara公司，引物序列：心房钠尿肽（ANP）上 游 引 物5'-CGTATACAGTGCGGTGTCCA-3'，下 游 引 物 5'-GGTTGACTTCCCCAGTCCAG-3'；B型 利 钠 肽（BNP） 上 游 引 物5'-AGCTGCTGGAGCTGATAAGAG-3'， 下 游 引 物5'-CTGCCCAAAGCAGCTTGAAC-3'；GPER1 上 游 引物5'-CCATCATCGGCCTGTGCTAT-3'，下游引物5'-GAAGACAAGGACCACTGCGA-3'；GAPDH 上游引物5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

统计学方法：数据采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5软件进行分析。计量资料以±s表示，组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大

Ang Ⅱ（0、50、100 和 250 nmol/L）诱导心肌细胞24 h。各组心肌细胞表面积分别为（1 343.6±202.9）μm2，（1 657.3±168.6）μm2，（2 603.1±381.7）μm2， （3 350.0±413.3）μm2。qRT-PCR检测结果，与空白对照组相比，AngⅡ（100 nmol/L） 组的心肌细胞表面积明显增大（P＜0.01）。

2.2 心肌细胞中存在G蛋白偶联雌激素受体1的表达（图 1）

图1 细胞免疫荧光染色、蛋白免疫印迹法、荧光定量逆转录聚合酶链式反应监测心肌细胞G蛋白偶联雌激素受体1的表达

心肌细胞特异性免疫荧光（抗GPER1，绿光）染色结果显示（图1A），AngⅡ组、AngⅡ+G1组和AngⅡ+G15组肥大心肌细胞GPER1蛋白表达均较空白对照组明显增加。Western-blot结果显示（图1B），AngⅡ组、AngⅡ+G1组和AngⅡ+G15组肥大心肌细胞GPER1蛋白表达水平均较空白对照组略有升高（P均＜0.05），AngⅡ+G1组和AngⅡ+G15组对GPER1蛋白表达无差异（P＞0.05）。qRT-PCR结果显示（图1C），AngⅡ组、AngⅡ+G1组和AngⅡ+G15组肥大心肌细胞GPER1 mRNA水平均较空白对照组均明显升高（P均＜0.05）。

2.3 激活G蛋白偶联雌激素受体1可以降低心肌细胞心房钠尿肽和B型利钠肽信使核糖核酸水平（图2）

GPER1激活剂G1（10、100和1 000 nmol/L）和AngⅡ（100 nmol/L）共同作用于心肌细胞。qRT-PCR结果显示，与空白对照组相比，AngⅡ（100 nmol/L）组和AngⅡ+G1（10、100和1 000 nmol/L）组肥大心肌细胞ANP和BNP mRNA水平均明显升高（P＜0.01）。随着G1浓度的升高，ANP和BNP mRNA水平基本呈梯度降低，尤其是AngⅡ+G1（100、1 000 nmol/L）组与AngⅡ（100 nmol/L）组相比ANP和BNP mRNA水平均明显降低（P均＜0.05）。

图2 荧光定量逆转录聚合酶链式反应检测浓度梯度G蛋白偶联雌激素受体1激活剂对心肌细胞心房钠尿肽（2A） 和B型利钠肽信使核糖核酸（2B）的影响

2.4 各组乳鼠心肌细胞蛋白质质谱分析

蛋白质谱分析显示：空白对照组与AngⅡ组组间差异蛋白52种；AngⅡ组与AngⅡ+G1组组间差异蛋白36种。两组间差异蛋白交叉存在的5种关键基因是Fam120b、RGD1562310、Ctrb1、Rap1gap和Pag1。与空白对照组相比，AngⅡ组的Rap1gap蛋白高表达（比值=1.348 98，P=0.033 99），而与AngⅡ组相比，AngⅡ+G 1组的Rap1gap蛋白表达又相对低表达（比值=0.743 79，P=0.017 02）。

2.5 激活G蛋白偶联雌激素受体1参与调控心肌细胞的信号通路（图3）

Western-blot结果显示，与空白对照组或AngⅡ组相比，AngⅡ+G1组p-AKT和p-ERK蛋白表达均有显著升高（P＜0.01）。AngⅡ+G1+G15组与AngⅡ+G1组相比，p-AKT和p-ERK蛋白表达降低（P均＜0.05）。AngⅡ+G1+U0126组与 AngⅡ +G1组相比，p-ERK蛋白表达水平降低（P均＜0.01），而p-AKT蛋白表达水平无变化（P＞0.05）；AngⅡ+G1+MK2206组与AngⅡ+G1组相比，其p-AKT和p-ERK蛋白表达水平均有明显降低（P均＜0.01）。

图3 蛋白免疫印迹法检测6组心肌细胞丝氨酸/苏氨酸激酶（3A）和细胞外调节蛋白激酶蛋白磷酸化（3B）水平的影响

2.6 G蛋白偶联雌激素受体1参与缓解心肌细胞肥大可能主要与丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路有关（图4）

qRT-PCR结果显示，与空白对照组比，AngⅡ组ANP和BNP mRNA水平均有显著升高（P＜0.01）。与AngⅡ组比，AngⅡ+G1组ANP和BNP mRNA水平均有明显降低（P＜0.01）。与 AngⅡ组或AngⅡ+G1组相比，AngⅡ+G1+MK2206组ANP和BNP mRNA水平均有明显升高（P均＜0.01）。

2.7 激活G蛋白偶联雌激素受体1对心肌细胞凋亡和自噬的影响（图5）

流式细胞技术检测结果显示，空白对照组、AngⅡ组和AngⅡ+G1组的凋亡水平差异无统计学意义（P＞0.05）。Western-blot结果显示，与空白对照组相比，AngⅡ组LC3II/LC3I增大（P＜0.01）；与AngⅡ组相比，AngⅡ+G1组LC3II/LC3I减小（P＜0.01）。与AngⅡ+G1组相比，AngⅡ+G1+G15组心肌细胞LC3II/LC3I比值升高（P＜0.01）。

图4 荧光定量逆转录聚合酶链式反应检测丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂对心肌细胞心房钠尿肽（4A）和B型利钠肽信使核糖核酸（4B）水平的影响

图5 蛋白免疫印迹检测激活G蛋白偶联雌激素受体1对心肌细胞胞浆型自噬标记轻链3和膜型自噬标记轻链3表达的影响

3 讨论

女性健康指南（WHI）随机控制试验和心脏雌激素重施（HERS）试验均未得出雌激素对心血管系统保护作用的支持性结论，并且绝经期女性外源性雌激素替代治疗可能增加女性生殖系统肿瘤[15]，限制了临床应用雌激素来保护心肌的相关研究的开展。新型膜雌激素受体GPER1的发现为雌激素抗心血管疾病的研究带来了新的希望。本研究主要探讨激活GPER1快速信号转导途径对心肌细胞的影响。本研究通过免疫荧光染色，Western-blot和qRT-PCR技术发现，大鼠原代心肌细胞存在GPER1的表达，这与De Francesco等[16]的研究结果是相互印证的。

缓解心肌细胞肥大是防止心脏肥厚进一步恶化的关键。ANP和BNP是重要的心脏神经内分泌激素，与心脏压力负荷和容量负荷的增加有关，其mRNA水平是衡量心肌肥厚和心力衰竭的重要指标[17]。激活的GPER1能有效缓解心肌细胞肥大，该作用可被G15和MK2206阻断。这就为雌激素替代疗法提供了新的可能。单纯激活GPER1既可以缓解细胞肥大，又相对之前的雌激素替代疗法更加安全。

生物信息学分析结果显示Rap1gap蛋白分子下游的B-Raf/Raf-1-MEK-ERK信号通路、MAPK信号通路和PI3K-AKT信号通路参与GPER1介导的心肌细胞调控的关键信号通路。ERK信号通路与细胞的核转录作用有关，而AKT信号通路可能与心肌细胞的生长、肥大和存活相关。本研究Western-blot结果显示，AKT和ERK参与GPER1介导的抗心肌细胞肥大作用，且MK2206（AKT特异性抑制剂）可同时抑制p-AKT和p-ERK蛋白表达。这就说明，PI3K-AKT信号通路和MEK-ERK信号通路可能存在交叉，AKT可能参与调控ERK的表达。

哺乳动物的雷帕霉素靶（mTOR）作为AKT下游重要蛋白分子，是一种非典型AKT，可以影响基因转录与蛋白质翻译，参与调控细胞生长、增殖等过程，与蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢、细胞凋亡及自噬等均有联系[18]。相关实验证实，雷帕霉素能抑制心肌细胞肥大，肥大过程中蛋白质合成的增加与AKT-mTOR信号通路的激活有关，雷帕霉素和PI3K抑制剂均能抑制肥大过程中蛋白质的合成[19]。细胞凋亡和自噬作为细胞维持内环境稳态的重要机制，都有可能参与心肌细胞肥大的调控。但本研究证实，GPER1介导的抗心肌细胞肥大作用可能与细胞凋亡无关，而与细胞自噬相关。GPER1受体可能通过PI3K-AKT-mTOR信号通路介导细胞自噬发挥抗心肌细胞肥大作用。然而，自噬与mTOR通路之间的关系非常复杂，而且GPER1的激活mTOR的具体机制，以及TORC1和mTORC2的相互调节作用仍需要进一步研究揭示。

我们目前的研究尚处于起始阶段，对GPER1生物功能的理解还不够深入，随着研究的深入，GPER1的潜在致癌作用（特别是妇科癌症，如卵巢癌[20]和乳腺癌[21]）和心血管保护功能将逐渐被揭示。

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