王 政，杨大娟，何松林,2*，毛仓仓，孟新亚，贺 丹

(1.河南农业大学 林学院，河南 郑州 450002； 2.河南科技学院，河南 新乡 453003)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)，芍药科芍药属木本花卉，又名富贵花、木芍药、鼠谷花等，为我国传统名花，也是著名观赏与药用植物[1]。其株型端庄，花色艳丽，具有较高的观赏价值和药用价值。传统的牡丹繁殖方式存在育种周期长、繁殖系数低等问题，导致其种植和生产难以形成规模，无法满足牡丹产业化及商业化生产需求；现代生物育种为缩短育种周期提供可能，但其离体快繁体系仍不完善，生根率低且质量不高，通过体细胞胚诱导产生再生植株将有效解决这一难题[2-4]。虽已利用牡丹凤丹白愈伤组织[5]、凤丹白绿色子叶[6]间接诱导出球形胚及以紫斑牡丹合子胚[7]为外植体直接诱导出体细胞胚并获得少量再生植株，但牡丹体细胞胚发生频率仍然很低，畸形胚发生概率大，且同步化发生困难[8]。有研究表明，毒莠定(PIC)对胚性愈伤组织的形成具有一定的作用，PIC是一种新型植物生长调节剂，适当浓度的PIC可诱导草莓叶柄和雄蕊、百子莲产生胚性愈伤组织[9-10]。光照在体细胞胚发生中也具有较为重要的作用，长光周期可促进孜然、栓皮栎体细胞胚诱导及川滇高山栎未成熟的合子胚体细胞胚形成[11-13]。目前研究表明，适宜浓度的PIC可以促进牡丹体细胞胚诱导[3]，但不同光暗条件及PIC浓度对其体细胞胚诱导过程中生理生化的影响尚未见报道。鉴于此，以牡丹品种凤丹白鳞芽为材料，研究不同光暗处理和PIC浓度处理条件下牡丹体细胞胚早期发生时期及其诱导过程中内源激素、可溶性蛋白含量及酶活性的动态变化，以期为体细胞胚发生机制相关研究提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 外植体选择及处理 以牡丹凤丹白(P.suffruticosa‘Fengdanbai’)未萌动的鳞芽为外植体(采自洛阳神州牡丹园苗木基地)，除去表面一层鳞片后，在自来水下冲洗30 min放在超净工作台上，进行消毒灭菌。具体消毒方法为：75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗2 min (2次)，0.1% HgCl2消毒8 min，无菌水冲洗2 min(2次)，无菌水冲洗3 min(2次)。

1.1.2 愈伤组织的获得 将消毒后的牡丹鳞芽剥去外部鳞片，将芽接种到MS+Ca2+(WPM)+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.0 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH=5.8)的固体培养基上，在常规培养条件，即温度(24±1) ℃，光照时间12 h/d，光强40 μmol/(m2·s)下诱导培养40 d，获得试管苗。将试管苗的叶柄转入1/2MS+Ca2+(WPM)+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH=5.8)的固体培养基上，在常规培养条件下诱导培养40 d，获得愈伤组织。

1.1.3 愈伤组织增殖培养 将愈伤组织转入1/2MS+Ca2+(WPM)+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L(pH=5.8)的固体培养基上，在常规培养条件下培养，作为供试材料。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 根据前期的研究结果，选定4.0 mg/L PIC为体细胞胚培养最适质量浓度[14]，研究设置2个处理和2个对照：处理1 (光/暗12 h/12 h、PIC 4.0 mg/L)，处理2 (光/暗0 h/24 h、PIC 4.0 mg/L)，光CK (光/暗12 h/12 h、PIC 0 mg/L)，暗CK (光/暗0 h/24 h、PIC 0 mg/L)。处理1和处理2均以MS+6-BA 0.5 mg/L+PIC 4.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L (pH=5.8)为培养基，光CK和暗CK均以MS+6-BA 0.5 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L (pH=5.8)为培养基，每个处理15瓶，每瓶接种3块愈伤组织。

1.2.2 指标测定 分别于诱导培养时期的0、6、12、18、24、30、36 d测定相关指标：吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、可溶性蛋白含量，过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性变化。采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行内源激素含量的测定，试剂盒购买于中国农业大学；采用愈创木酚法测定POD活性[15]；采用氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活性[15]；采用KMnO4法测定CAT活性[15]；采用Nakano等[16]的方法测定APX活性；采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量[17]；采用石蜡切片[18-19]进行细胞形态学观察。

1.2.3 数据分析 试验数据均采取邓肯氏新复极差测验法检测差异显著性，Excel 2003及DPS 7.05软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 细胞学观察结果

如图1所示，通过形态学观察发现，处理1 (图1A)和处理2 (图1B)条件下的凤丹白愈伤组织较大，但相比于处理1，处理2条件下的愈伤组织颜色较白；光CK (图1C)条件下产生的愈伤组织较小，暗CK (图1D)条件下的产生的愈伤组织最小且有些发黄。与没有添加PIC的对照相比，添加PIC条件下(处理1和处理2)产生的愈伤组织较大。与暗培养条件下相比，处于光照12 h/d的条件下(处理1和光CK)产生的愈伤组织较绿。

如图2所示，通过大量的石蜡切片观察发现，不同处理对牡丹体细胞胚发生时间影响明显。在处理1条件下，凤丹白愈伤组织在诱导培养的18 d开始形成少量胚性细胞(图2A)，24 d有大量胚性细胞出现(图2B)，在30 d出现球形胚(图2C)，36 d形成大量的球形胚并伴有少量的心形胚(图2D、E)；处理2条件下也形成了球形胚(图2F)，但其时间相比于处理1晚6 d，而且数量很少；光CK和暗CK条件下则在36 d仍没有出现球形胚。

A：处理1；B：处理2；C：光CK；D：暗CK图1 不同培养环境下培养36 d凤丹白体细胞胚发生宏观情况

A：18 d处理1下胚性细胞开始形成；B：24 d处理1下胚性细胞大量形成；C：30 d处理1下早期球形胚开始形成；D：36 d处理1下球形胚大量形成；E：36 d处理1下心形胚的形成；F：36 d处理2下球形胚的形成图2 添加PIC后凤丹白体细胞胚发生微观情况(100倍)

2.2 内源激素含量的变化

2.2.1 IAA含量 如图3所示，在体细胞胚发生过程中，处理1和处理2的IAA含量整体呈先上升后下降的趋势，并均于30 d出现峰值(365.31、325.52 ng/g)，处理1的IAA含量整体高于处理2 (12 d除外)。光CK与暗CK的IAA含量变化整体均呈现下降趋势，且暗CK的IAA含量整体高于光CK (除24、36 d外)。同时发现有光、无光情况下添加PIC处理可显著提高IAA含量，特别是在12～36 d处理1和处理2的IAA含量水平显著高于光CK和暗CK，且处理1的IAA含量在18～30 d(胚性细胞形成期及球形胚形成期)显著高于其他处理，说明光照对IAA含量的促进作用不明显。

不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同图3 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中IAA含量变化

2.2.2 GA3含量 如图4所示，在体细胞胚发生过程中，处理1和处理2的GA3含量变化整体呈下降趋势，均于36 d降到最小值，分别为2.81、6.25 ng/g。暗CK处理下GA3含量变化整体呈先下降后上升趋势，在12 d降至最低值(10.81 ng/g)，随后上升，并于36 d达到最大值(23.91 ng/g)。光CK处理下的GA3含量在0～18 d迅速下降至最低值(10.81 ng/g)后，于18～24 d又急速上升至最大值(17.15 ng/g)，之后逐渐下降。同时发现添加PIC处理可以显著降低GA3含量，而暗培养条件下有利于GA3含量的升高，特别是在18～30 d(胚性细胞形成期及球形胚形成期)处理1和处理2的GA3含量水平均低于光CK和暗CK，并产生显著差异，处理2的GA3含量水平高于处理1，暗CK的GA3含量水平高于光CK。

图4 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中GA3含量变化

2.2.3 ABA含量 如图5所示，在体细胞胚发生过程中，处理1和处理2的ABA含量变化在6～30 d整体呈上升趋势，且均于30 d达到最大值，分别为426.38、555.59 ng/g，之后开始下降。而光CK与暗CK的ABA含量变化整体呈先上升后下降的趋势，均于0～12 d上升到最大值后迅速下降，且分别于24 d和30 d达到最小值后缓慢回升。处理1和处理2的ABA含量峰值显著高于光CK与暗CK，且峰值时期推迟了18 d。同时发现添加PIC条件下在胚性愈伤组织形成前期ABA含量显著低于对照，但在胚性愈伤组织形成后期ABA含量显著升高，尤其在18～36 d(胚性细胞形成期及球形胚形成后期)处理1和处理2的整体趋势高于光CK和暗CK。

图5 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中ABA含量变化

2.2.4 内源激素平衡 如图6所示，在体细胞胚发生过程中，处理1和处理2的ABA/IAA比值在18～36 d呈现上升的趋势，且整体始终保持平稳增长态势，均于36 d出现最高值，其中处理2的变化幅度大于处理1；光CK与暗CK的ABA/IAA比值整体呈先上升后下降的趋势，均于12 d达到最大值后迅速下降；添加PIC条件下在胚性愈伤组织形成前期低于对照，尤其在12～18 d处理1和处理2低于光CK和暗CK，但在胚性愈伤组织形成后期PIC可促进ABA/IAA比值平稳增长，而光CK和暗CK则迅速下降。

图6 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中ABA/IAA比值变化

如图7所示，在体细胞胚发生过程中，处理1和处理2的ABA/GA3比值均逐渐上升，于18～36 d出现大幅度上升，且根据细胞学观察可知处理1在18～24 d有大量胚性细胞出现，在30 d出现球形胚，36 d形成大量的球形胚并伴有少量的心形胚。光CK与暗CK的ABA/GA3比值整体呈先上升后下降趋势，同时发现添加PIC处理可以显著提高ABA/GA3比值，尤其在18～36 d处理1和处理2的ABA/GA3比值显著高于光CK和暗CK。

图7 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中ABA/GA3比值变化

2.3 可溶性蛋白含量的变化

如图8所示，在体细胞胚诱导过程中，处理1和处理2的蛋白质含量整体呈先上升后下降趋势，并分别于30 d和24 d达到最大值(3.96、2.15 mg/g)。光CK与暗CK的蛋白质含量整体呈先下降后上升趋势，并在18 d分别出现最小值(1.03、1.97 mg/g)，在36 d分别出现最大值(1.97、1.64 mg/g)。同时发现光照和添加PIC条件协同促进蛋白质含量的升高，特别在18～36 d处理1的蛋白质含量始终显著高于其他处理；在12～36 d光CK始终高于暗CK，说明光照能显著促进蛋白质含量的升高。

图8 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中可溶性蛋白含量变化

2.4 抗氧化酶活性的变化

2.4.1 POD活性 如图9所示，在体细胞胚诱导过程中，处理1和处理2的POD活性整体呈“上升—下降”的波动趋势，最大值[226.41、205.70 U/(g·min)]均在30 d出现。光CK的POD活性整体呈“下降—上升—下降”的趋势，并在12 d出现最小值[80.93 U/(g·min)]，30 d出现峰值[156.19 U/(g·min)]；暗CK的POD活性呈“上升—下降—上升”的趋势，分别在12 d出现最大值[154.15 U/(g·min)]和18 d出现最小值[84.63 U/(g·min)]后开始缓慢上升。同时发现添加PIC处理可以显著促进POD活性的升高，尤其在18～36 d处理1和处理2的POD活性始终高于光CK和暗CK，且差异显著。

图9 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中POD活性变化

2.4.2 SOD活性 如图10所示，在体细胞胚诱导过程中，处理1和处理2的SOD活性呈“上升—下降—上升”的趋势，并分别在18 d和12 d出现峰值[168.78、176.50 U/(g·min)]，而分别在30 d和24 d降到最小值[65.91、64.20 U/(g·min)]。光CK的SOD活性呈“上升—下降—上升”的急剧变化趋势，并分别在12 d和30 d出现峰值[150.24 U/(g·min)]和最小值[98.77 U/(g·min)]，暗CK的SOD活性变化相对平稳，0～24 d缓慢上升且到24 d出现最大值[149.13 U/(g·min)]后开始缓慢下降。处理1的SOD活性峰值比光CK提高了9.49%，处理1的SOD活性谷值的出现比处理2推迟了6 d，且在18～36 d暗CK显著高于光CK，说明光照条件下有助于SOD活性的降低及趋势的推迟。根据细胞学观察，处理1在18～30 d胚性细胞形成分化期的SOD活性逐渐降低，球形胚形成后期(30～36 d)急剧上升。

图10 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中SOD活性变化

2.4.3 CAT活性 如图11所示，在体细胞胚发生过程中，处理1和处理2的CAT活性整体呈先上升后下降趋势，并均在30 d快速上升到最大值[382.50、413.50 U/(g·min)]，30～36 d均大幅下降。光CK的CAT活性在0～30 d上升至最大值[187.50 U/(g·min)]后下降；暗CK的CAT活性从0～30 d缓慢下降到最小值[137.50 U/(g·min)]后上升。处理1和处理2的CAT活性始终高于光CK和暗CK，且在30～36 d显著高于光CK和暗CK；18～24 d 胚性细胞大量形成期，处理1的CAT活性显著高于其他处理，30 d球形胚形成期的CAT活性，处理1比光CK提高了104.01%，处理2比暗CK提高了401.52%。同时发现光照和添加PIC处理协同促进CAT活性的升高，尤其在18～36 d处理1的CAT活性显著高于处理2(30 d除外)，在24～36 d光CK的CAT活性显著高于暗CK。

图11 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中CAT活性变化

2.4.4 APX活性 如图12所示，在体细胞胚发生过程中，处理1的APX活性呈“下降—上升”趋势，于30 d出现最小值[0.45 U/(g·min)]后迅速上升至36 d达到最大值[0.84 U/(g·min)]；处理2的APX活性呈“上升—下降—上升”趋势，并于30 d降至最小值[1.21 U/(g·min)]，30～36 d迅速升至最大值[2.03 U/(g·min)]。光CK和暗CK的APX活性均呈“上升—下降—上升”趋势，并分别在30、 24 d下降到最小值[0.60、1.40 U/(g·min)]后持续上升。同时发现光照有助于APX活性的降低，在6～36 d处理2和暗CK的APX活性始终高于处理1和光CK，在18～30 d APX活性急剧下降，各处理在球形胚形成后期(30～36 d)的APX活性均逐渐回升。

图12 凤丹白体细胞胚发生早期诱导过程中APX活性变化

3 结论与讨论

光照不仅是植物光合作用的能量来源，同时影响着细胞的分化和形态发生。研究表明，体细胞胚的间接发生多在黑暗条件下进行，而直接发生多在16 h/8 h 的光/暗交替条件下进行[19]。光培养下体细胞胚生长迅速且健壮，在暗培养下仅部分体细胞胚在发育过程中会愈伤组织化，且诱导出的愈伤组织在去掉激素后需要较长的时间才能分化出体细胞胚[12]。由此可见，光照对愈伤组织培养的作用因植物种类和基因型不同而存在差异。植物组织培养中生长调节剂是影响植株再生的主要因素，PIC的作用机制与2,4-D类似，是诱导外植体脱分化的生长素之一。近期研究表明，PIC可以代替2,4-D更好地诱导香蕉[20]和洋葱[21]的胚性愈伤组织产生体细胞胚。适宜浓度的PIC能够诱导牡丹[3]和山核桃[22]幼胚产生胚性愈伤组织及体细胞胚，且进一步培养可产生体细胞胚。本试验结果表明，处理1 (光/暗12 h/12 h、PIC 4.0 mg/L)和处理2(光/暗0 h/24 h、PIC 4.0 mg/L)条件下产生的愈伤组织生长迅速；与暗CK(光/暗0 h/24 h、PIC 0 mg/L)相比，处于光CK(光/暗12 h/12 h、PIC 0 mg/L)条件下的愈伤组织长势较好；处理1条件下的球形胚出现最早。

有研究表明，在北五味子、红松、橡胶树和尾巨桉等[23-26]体细胞胚发生过程中，IAA、ABA及GA3含量变化与之相关。本试验研究发现，处理1条件下诱导培养18 d形成少量胚性细胞，24 d出现大量胚性细胞，30 d出现球形胚，36 d形成少量心形胚。牡丹愈伤组织IAA含量在0～30 d一直呈上升趋势，这与赖钟雄等[27]、潘晓等[28]的研究发现IAA含量升高有助于体细胞胚的早期发育一致；外源添加PIC条件下出现胚性愈伤组织较多，且其内源IAA的含量水平均远高于光CK和暗CK，这与陈以峰等[29]在水稻体细胞胚研究中发现内源IAA的含量水平在胚性愈伤组织中远高于非胚性愈伤组织的结果一致；外源添加PIC条件下的GA3含量变化整体呈下降趋势，均于36 d达到最小值，在36 d心形胚阶段降至最低，这与黄道斌[30]在茶树体细胞胚发生研究中发现GA3含量与胚性细胞形成呈负相关的结果相似；ABA含量的变化趋势与IAA的相似，处理1条件下的ABA含量在0～30 d整体上呈上升趋势，这与崔凯荣等[31]在枸杞体细胞胚研究中发现ABA含量升高有助于体细胞胚的早期发育一致；外源添加PIC条件下ABA/IAA比值整体呈平稳上升趋势，虽光CK下的ABA/IAA比值在愈伤组织形成中后期高于处理1，但其呈下降趋势；外源添加PIC条件下的ABA/GA3比值整体呈上升趋势且在24～36 d开始出现剧烈变化，大幅度上升，即在胚性愈伤组织形成中后期ABA/GA3比值升高；与潘晓等[28]研究发现香蕉胚性愈伤组织形成中后期ABA/GA3升高有利于香蕉胚性能力的表达和ABA/IAA升高有利于体细胞胚发育成熟一致，表明IAA、GA3、ABA及其比值对牡丹细胞胚性的启动、发生、发育具有较大的影响。

有研究表明，在体细胞胚发生过程中蛋白质、POD、CAT、SOD及APX均参与葡萄风信子、胡桃楸和滇楸等[32-34]植物的体细胞胚发生。本试验中，愈伤组织在体细胞胚发生过程中，外源添加PIC条件下蛋白质合成速率整体呈上升趋势，分别于30、24 d达到最大值，此时也正是球形胚的形成时期，蛋白质的积累为其提供了一定的物质基础，这与潘晓等[28]研究结果一致，说明胚性愈伤组织细胞蛋白质的合成代谢活跃，可能与体细胞胚分化过程中可溶性蛋白向结构蛋白转化积累有关[35]；外源添加PIC条件下的POD活性呈“上升—下降”波动趋势，在30 d达到最大值，此时正是球形胚的形成时期，表明高POD活性可以促进胚性细胞诱导及体细胞胚早期发生，同时说明牡丹球形胚时期的能量代谢旺盛，可以为后期的体细胞胚发生提供能量，而高POD活性和蛋白质水平为球形胚的大量形成提供了物质和能量基础[36]；外源添加PIC条件下，CAT活性与POD活性的变化趋势基本一致，这与潘晓等[28]的研究发现CAT活性的升高能够促进胚性细胞的形成和早期发育一致；而外源添加PIC条件下的SOD活性呈“上升—下降—上升”趋势，分别在30、24 d降到最小，之后又迅速回升，这与王静等[37]研究木薯体细胞胚发生过程中SOD活性变化趋势一致，表明SOD活性升高有助于胚性细胞早期发育，活性降低有助于胚性细胞分化；外源添加PIC条件下APX活性在12～30 d缓慢下降且降幅很小，30～36 d迅速增加即在诱导胚性愈伤组织及早期体细胞胚发生时期变化不明显，而在体细胞胚发育阶段迅速增加，与李惠华等[38]的试验发现APX活性升高有助于体细胞胚发育情况一致。

因此，本研究认为光照和外源添加PIC可以显著提高牡丹胚性愈伤组织形成过程中的IAA含量、蛋白质含量、CAT活性、ABA含量、ABA/GA3比值及POD活性，并降低GA3含量和APX活性。而关于光照和PIC对牡丹体细胞胚发生的作用机制还有待后期进一步深入研究。

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