应东山 唐浩 韩瑞玺 王文林 王明 王琴飞 汤秀华 张如莲

摘  要  利用转录测序技术，开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs），为SSR标记在油梨种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用Illumina二代测序的技术，共获得37 639条无冗余的序列，对其进行SSR搜索，共获得6 419条简单序列重复（SSR）。利用Primer 3.0软件设计SSR引物，并以11份油梨种质筛选多态性引物。基于转录组序列开发出的EST-SSR的分布频率为17.05%。在油梨EST-SSR中，单核苷、二核苷和三核苷的重复占主导，占总数的99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总SSR的37.47%、31.80%和29.80%;出现频率最高的二核苷酸重复基元是AG/CT，占总数的29.15%，出现最高的三核苷酸重复基元为AAG/CTT，占12.01%。随机选择315个SSR位点合成引物，经11份油梨种质筛选鉴定，227对引物可扩增获得产物，有效扩增率为72.06%;其中34对引物表现出良好多态性，占有效引物的12.78%，占总引物的10.79%。在34对多态性引物中，每对引物扩增等位基因数2～12个。利用高通量测序开发SSR 引物有较好的实用性，开发获得的34个具有多态性的油梨SSR标记可用于研究油梨及其相关近缘物种的遗传变异。

关键词  油梨;转录组;EST-SSR;引物中图分类号  S31      文献标识码  A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.017

油梨（2n=24，Persea americanaMill.）是樟科（Lauraceae）油梨属常绿乔木果树，富含脂肪、热能高，故有“森林黄油”之美称，是重要的热带果树之一。油梨起源于中美洲地区，目前在美国、危地马拉、墨西哥及古巴等地区栽培最多，也是最早在中美洲商业化的水果之一^[1]。油梨早在公元前500年就在墨西哥栽培种植^[2]，在其主产区危地马拉、墨西哥及非洲一些国家，人们把油梨作为主食达半年以上，因而油梨具有良好的社会效益，同时，因其四季常绿、树姿优美，也可作优良的绿化树种。目前所有的油梨栽培品种都属于P.americana种，有4个亚小种，俗称墨西哥系、西印度系和危地马拉系，另外还有一个杂交种系^[3]。

近年来，随着生物技术的快速发展，利用高通量测序技术开发油梨分子标记优势明显，由于不存在物种选择性、测序灵敏度高、无需特异性探针等，特别是对尚未公布基因组测序信息的物种，转录组测序能够快速高效地呈现出覆盖面广、准确度高的信息，而成为SSR、SNP等分子标记开发的良好工具，被广泛应用于植物的遗传育种、种质资源保护和开发等领域。转录组测序主要有以下五点优势：①包容性广，不受限制;②分辨率高，结果准确度好，不易受传统技术问题干扰;③灵敏度高;④测序通量高，单次检测上百亿个碱基序列;⑤重复性好，无需技术重复。在已完成基因组测序的作物上，其转录组测序获得的原始数据与基因组序列进行比对，能快速寻找差异基因^[4-7]。目前，利用转录组测序开发SSR标记已广泛应用于其他植物^[8-12]。王明等^[13]利用454高通量测序技术开发获得8 831条芒果SSR。李淑斌等^[14]利用草莓基因组序列高通量开发月季SSR标记，共识别49 029个SSR位点，成功对21 288个SSR位点设计引物。戴亚平^[7]利用Illumina转录组测序开发短丝木犀SSR，成功设计2 366对引物。魏明明^[15]利用Illumina开发茄子858对SSR分子标记。郑纪伟^[16]利用柳树转录组高通量测序开发SSR标记，分别在垂柳和簸箕柳中成功设计459和729对引物。综上所述，基于高通量的SSR标记开发在多种植物的研究已经取得了巨大进展，可以应用于热带果树，而热带果树油梨的分子标记开发和利用研究还比较少，目前只有有限数量的SSR可用于油梨遗传多样性分析。Ashworth等^[17]通过Hass油梨品种的2个基因组DNA文库来构建开发了25对SSR引物。Borrone等^[18]通过对已经发表的油梨表达序列标签数据库进行微卫星序列筛选，开发出70对微卫星序列引物。Gross-German等^[19]利用构建油梨基因组小片段SSR富集文库和已知EST序列库开发47个新的油梨SSR标记，多态性较好的40个SSR（其中25个SSR和15个EST-SSR）。利用高通量技术开发新的油梨SSR分子标记在国内外文献中未见相关报道。

本研究利用转录组测序技术，开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs），以期为中国油梨种质资源进行系统的遗传研究和构建油梨遗传图谱，以及在选育新品种和改良栽培品种上挖掘优异的基因资源，培育抗性强、高产、优质的油梨品种等研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

转录组测序样本来自海南大学油梨种质圃的Hass嫩叶，液氮速冻后送派森诺生物科技股份有限公司（上海）进行转录组Illumina NextSeq500测序。

遗传多样性研究使用的11份油梨样本（表1），来自广西亚热带农业科学研究所油梨种质资源圃和海南大學油梨种质圃。

1.2  DNA提取

实验采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA^[20]。

1.3  EST序列来源、SSR检测及SSR引物设计

本研究涉及的油梨EST序列来源于实验室将HASS叶片样品送派森诺公司转录组测序所得，并利用MISA软件对所有测序所得的转录本进行检测、筛选与分析SSR，最终确定SSR 位点。根据SSR搜索标准，将一、二、三、四、五和六核苷酸的最少重复次数的筛选标准分别设置为10、6、5、5、5、5，同时搜索复合SSR，统计不同SSR 类型在转录组中的密度分布。结合SSR位点两端保守的特点，利用Primer 3.0引物设计软件进行批量设计引物。从二～六核苷酸重复基元中随机挑選315对预期扩增产物为100～500 bp的SSR引物，交由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，用于11份油梨种质SSR引物筛选。

1.4  SSR引物筛选和验证

利用11份油梨种质对合成的315对引物进行引物有效性扩增和筛选多态性，根据条带扩增效果，统计目的条带扩增稳定、清晰的引物。

PCR反应体系15.0 μL，包括：10×Buffer（Mg²⁺ Plus）1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL，正反向引物（5 μmol/μL）各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL

（50 ng/μL），Taq酶1 U，超纯水补足至15.0 μL。PCR程序为：94 ℃ 5 min;33个循环（94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min）;最后72 ℃ 5 min。PCR产物用琼脂糖检测，再利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1×TBE，60 W恒功率电泳分离1.0 h，硝酸银染色，拍照。

2  结果与分析

2.1  油梨转录组SSR位点分布频率与基序特征

从油梨转录组测序结果，共包含37 639条Unigenes序列，总长为23 605 Mb，GC%为47.31，其中检测到5 292条序列上包含了共6 419个SSR 位点。其中复合SSRs有428条，占总SSR的6.67%，含有2个或2个以上SSR位点的序列有909条，占总SSR的17.18%。

油梨的二～六核苷酸重复基元的EST-SSRs分布频率情况见表2。其中单碱基重复基元占比最高，为37.47%;二碱基重复基元次之，为31.80%;三碱基重复基元为29.80%; 四～六碱基重复基元最低，仅为0.93%。从重复次数看（表2），二～

油梨EST-SSR基元类型分布情况（表3）。单碱基重复基元有98.46%为（A/T）n形式;仅有1.54%为（C/G）n形式。二碱基重复基元有91.67%

为（AG/CT）n形式，占SSR总数的29.15%;而仅占本类基序比例最小的形式为（CG/CG）n形式，仅有0.24%，为SSR 总数的0.08%。三碱基重复基元有40.30%为（AAG/CTT）n形式，其次为（AGG/ CCT）n，占17.83%，（AGC/CTG）n占13.49%，（ACT/ AGT）n的形式最少，仅有0.78%。四～六碱基重复型的重复基元类型多，但数量少，仅为SSR总数的0.93%。

2.2  EST-SSR引物设计筛选和验证

5 292条油梨转录组序列中，成功设计包括二～六核苷酸重复的SSR位点引物1 083条，涉及90种基元类型，其中出现频次大于10的基元类型如图2所示，其中CT/TC为主要基序类型，占13.02%，基序类型AGA次之，占4.43%，基序类型GAA占4.25%，AAG 和CAG均占4.06%。

随后，从1 083条引物中随机挑选、合成315对SSR引物，并用11份油梨种质对合成的315对引物扩增效果进行检验。其中，88对未扩增出条带，占27.94%;其中227对引物能扩增出条带，占设计引物总数的72.06%;34对引物在不同种群个体中扩增出多态性条带，占10.79%。图3为引物PA118在11份油梨种质中的扩增。

3  讨论

微卫星标记由于其广泛存在于真核生物的基因组上，已成为目前研究种质资源遗传多样性、基因组作图的首选标记。SSR分子标记开发途径主要包括基因组的SSR标记开发、应用已知EST数据库进行SSR标记开发以及通过同源物种转移开发SSR等。传统上基因组开发SSR标记，通过片段化酶切基因组、回收、测序、构建含SSR的序列小片段基因组文库，然后采用单克隆测序，成本高且操作繁杂、效率低下。Gross-German等^[19]利用构建油梨基因组小片段SSR富集文库和已知EST序列库开发47个新的油梨SSR标记，多态性较好的40个SSR，其中25个SSR和15个EST-SSR，EST-SSR开发效率为4%。本研究利用转录组测序技术开发油梨SSR共获得37 639条Unigene通过MISA软件进行SSR搜索，获得6 419个SSR，远高于采用其他方法开发的油梨SSR标记数量，

成功设计1 083条引物。随机挑选合成的315对引物筛选结果显示，227对引物能扩增出条带，有效率达到72.06%，说明从油梨转录组中设计开发分子标记引物有效率较高，有34对引物在11个种质材料间表现出较好的多态性，开发效率为10.79%。说明利用转录组测序技术SSR开发效率高于传统技术开发。

利用转录组开发花椒^[11]、红松^[21]、沙棘^[22]等具有多态性引物的EST-SSR，有效性分别为28.13%、15.84%和22.35%。本研究发现油梨EST-SSR位点多，但相对于其他作物多态性引物开发有效性不高。引物开发效率低的原因：①用于分析的油梨样品的数量和类型影响开发结果，样品种群规模小，选择存在一定的局限性;②油梨种质资源的局限性，国内油梨资源主要从国外引种，国内已报道的油梨资源100份左右^[23]，与一些发达国家收集的油梨资源千余份存在一定的差距，种质资源中国引种油梨只有100多年，且品种选育起步晚，水平较落后，只有桂研10号、桂垦系列等几个优良品系被推广种植的报道^[24]。③种群内部近交率频繁，种群间存在一定的隔离现象，种群间基因流阻断，导致种群内遗传多样性较低，多样性主要来自种群间。④可能是基因转录区的具有较高的保守性，种属间具备一定的通用性，利于后续的近缘物种间的应用。

研究发现，除单核苷酸重复基元以外，油梨中最为常见的重复基元为二碱基和三碱基，与王明^[13]、Jung^[25]等在芒果及蔷薇科植物中的研究结果相似。油梨的二碱基重复基元中，高达91.67%为（AG/CT）n形式，与水稻、玉米、小麦、大豆、夏蜡梅、花椒中二碱基重复基元出现频率最高的（AG/CT）n相同^{[11-12， 26]}。与夏蜡梅的相同^[12]，油梨的三碱基重复基元类型最多为（AAG/CTT）n;而芒果的三碱基重复基元中以（TTC/GAA）n类型最多^[13]，水稻、玉米、小麦、大豆的三碱基重复基元以（AAC/GTT）n类型最多^[26]，花椒的三碱基重复基元以（GAA/CTT）n类型最多^[11]。四～六碱基重复型的重复基元类型多，但数量少，仅为SSR总数的0.93%。

本研究开发了基于油梨转录组的SSR标记，为油梨种群的遗传多样性分析、亲本鉴定、交配系统估算、构建遗传连锁图谱等提供了新的途径，同时油梨EST序列的开发为挖掘新的SSR提供了丰富的资源，为油梨EST-SSR引物在近缘物种间拓展提供了新的途径。

4  结论

本研究结果表明，采用二代测序技术开发油梨SSR标记具有快速、简单、有效、经济等特点;成功开发获得的多态性的油梨SSR标记可用于研究油梨种质资源的遗传多样性分析及其相关近缘物种（如肉桂、樟树等）的遗传变异研究，同时为中国油梨品种选育及遗传改良提供有力的技术支持。

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