阳江华 龙翔宇 秦云霞 唐朝荣

摘 要 葉绿体内的淀粉是植物光合作用产物的重要临时储存形式，这些淀粉的降解需要β-淀粉酶（BAM）。β-淀粉酶基因是一个多基因家族，分别在不同组织中起着不同的作用，叶绿体β-淀粉酶在叶绿体淀粉降解过程中起着关键作用。利用橡胶树的转录组和基因组数据库，通过RT-PCR的方法获得一个橡胶树BAM基因，命名为HbBAM1。利用实时荧光定量PCR分析其在叶片中的表达模式，通过原核表达获得其重组蛋白，并分析其酶活性特点。同源性分析和亚细胞预测分析结果表明，HbBAM1定位于叶绿体中；HbBAM1原核表达产物的最适酶活性温度是35 ℃，其酶活性受到氧化型谷胱甘肽和双氧水等氧化剂的抑制。HbBAM1基因主要在橡胶树的花和叶片中表达；HbBAM1基因随着叶片的发育进程表达量逐渐增加，在淡绿期和稳定期叶片中表达量最大；HbBAM1基因在成熟叶片中的表达呈现明显的昼夜差异，在光合作用最强的上午10：00和下午16：00的表达量最大，晚上的表达量最低。上述结果表明，HbBAM1可能参与橡胶树叶片叶绿体内淀粉的降解，控制叶片气孔的开放与关闭，从而调控橡胶树叶片的光合作用。

关键词 巴西橡胶树；β-淀粉酶；HbBAM1；叶绿体

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract In chloroplast，starch is an important temporary storage form of photosynthetic products， and the degradation of the starch requires β-amylase（BAM）activity. β-amylase is a multi-gene family， which has different functions in different tissues. Plastic β-amylase plays a key role in starch degradation in chloroplast. Based on the transcriptome and genome data，an β-amylase gene， HbBAM1 was cloned by RT-PCR from Hevea brasiliensis. Real time RT-PCR（qRT-PCR）was used to characterize the expression pattern of HbBAM1 in the leaves. The recombinant protein of HbBAM1 was obtained by prokaryotic expression， and the characteristics of the enzyme activity was analyzed. HbBAM1 located in the chloroplast based on homology analysis and subcellular prediction. The optimum enzyme temperature of HbBAM1 was 35 ℃， the enzyme was suppressed by oxidant，oxidized glutathione and hydrogen peroxide. HbBAM1 was mainly expressed in the flowers and leaves. The expression of HbBAM1 was gradually increased in the leaf development process，peaked at the light green and stable stages. HbBAM1 displayed obvious circadian variations in the stable leaves，which had the highest expression level during the strongest photosynthesis time-10 oclock and 16 oclock， the lowest at night. It was presumed that HbBAM1 maight participate in the starch degradation in the chloroplast of H. brasiliensis，control the open and close of the stomas，regulates the photosynthesis of H. brasiliensis.

Key words Hevea brasiliensis； β-amylase； HbBAM1； chloroplast

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.015

植物叶肉细胞的叶绿体、种子和块茎等淀粉贮藏器官中均含有丰富的淀粉。β-淀粉酶（β-amylase，BAM）通过水解α-1，4-葡聚糖链，从淀粉的非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断，产生麦芽糖[1]。早期对β-淀粉酶的研究主要集中在长期存储淀粉的农作物种子或者块茎的农作物，如大麦、甘薯和大豆[2-4]。近年来，研究重点才转向研究β-淀粉酶在植物叶片淀粉代谢中的作用及β-淀粉酶在植物面临各种环境胁迫时的作用[5-6]。

在植物叶片淀粉的分解过程中，α-淀粉酶起着次要作用[7]，而植物β-淀粉酶起着关键作用[8-10]。β-淀粉酶是多基因家族，在拟南芥中有9个BAM基因，分为4个亚类，BAM1和BAM3是主要的负责淀粉降解的β-淀粉酶基因。在未开花的拟南芥幼嫩叶片中，BAM1主要在保卫细胞中表达，在白天通过降解淀粉，开启气孔[11]。BAM1的突变体bam1，其保卫细胞中含有更多的淀粉，减少气孔的打开，提高了bam1对渗透胁迫和干旱胁迫的耐受能力[11-12]。BAM3主要在晚上起作用，通过降解淀粉生成麦芽糖，为晚上植物的生长提供碳源。寒冷胁迫会上调拟南芥AtBAM3基因的表达[10]。在国内，Peng等[13]研究了枳树中拟南芥AtBAM3的同源基因PtrBAM1，结果发现PtrBAM1基因的表达受到CBF转录因子的调控，通过提高可溶性糖的含量，提高了枳树的耐寒能力。拟南芥的BAM4虽然没有β-淀粉酶活性，但其缺失突变体bam4的叶片淀粉降解受到抑制，其淀粉含量比野生型更高，BAM4可能以独立于BAM1和BAM3的途径，促进或者调控拟南芥的淀粉降解[14]。

本研究利用橡膠树转录组和基因组数据库，从橡胶树中获得一个拟南芥AtBAM1的同源基因HbBAM1，分析HbBAM1基因在同一天内不同时间点的表达变化，确定HbBAM1原核表达产物的最适酶活性温度，以及不同氧化剂对其酶活性的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡胶树，定植于中国热带农业科学院试验场3队，品系为热研7-33-97。

1.1.2 试剂和菌种 PCR产物克隆用的T载体为大连宝生物公司的pMD18-T，Taq DNA聚合酶和荧光定量试剂TransStart Tip Green qPCR SuperMix为北京全式金生物技术有限公司产品，蛋白预染marker、限制性核酸内切酶、反转录试剂盒为美国Thermo Scientific公司产品。DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒为美国Omega公司产品。通用植物总RNA提取试剂盒为北京百泰克生物技术有限公司产品。原核表达载体pGEX-4T-1和pET43.1a，大肠杆菌菌种Top10和BL21（DE3），为本实验室保存。引物由上海英俊生物技术公司合成，DNA测序在上海生工生物工程有限公司完成。可溶性淀粉为Sigma公司产品，其它生化试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理 7个不同组织的实验材料采自10年生、开割3 a的未进行乙烯利刺激割胶的橡胶树。不同时间点的叶片取自定植4 a的橡胶树的成熟期叶片的叶肉部分，以3株橡胶树的叶片混合为1个实验重复，共3个实验重复。

1.2.2 总RNA的提取及cDNA第一链的合成 巴西橡胶树不同组织的总RNA的提取，使用百泰克公司的通用植物总RNA提取试剂盒，方法参照说明书。cDNA第一链的合成使用Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，操作步骤依照产品说明书进行。

1.2.3 HbBAM1基因的克隆 通过搜索巴西橡胶树的转录组和基因组数据库，获得了AtBAM1基因在橡胶树中的同源基因HbBAM1的cDNA序列。设计了1对基因特异性引物HbBAM1-F和HbBAM1-R，以雄花和雌花的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，PCR产物为单一的条带。该条带经回收后，连接到pMD-18T载体中，转化Top10感受态细胞，37 ℃培养过夜，挑选5个经菌落PCR鉴定为阳性的克隆，送上海英俊生物技术公司进行测序验证。引物序列见表1。

1.2.4 HbBAM1基因的表达分析 HbBAM1基因的荧光定量PCR引物qBAM1-F和qBAM1-R，经测序确定引物正确。使用伯乐公司的CFX96 TOUCH实时荧光定量PCR仪，分析HbBAM1基因在不同组织、叶片不同时期和一天不同时间点叶片的表达变化。不同组织和叶片不同时期的内参基因为RH2b，一天不同时间点叶片的内参基因为UBC2a。内参基因的引物参照Li等[15]的论文。

1.2.5 HbBAM1原核表达载体的构建与表达 由于HbBAM1定位于叶绿体上，其定位于叶绿体的信号肽为疏水结构，可能会影响HbBAM1在大肠杆菌的表达，原核表达去除了HbBAM1的信号肽序列。以yBAM1-F 和yBAM1-R为引物，从第76个氨基酸开始，扩增HbBAM1基因的编码区序列。PCR扩增产物、原核表达载体pGEX-4T-1和pET43.1a都使用Bam HI和Sal I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶回收、连接转化Top10感受态。挑选阳性克隆，DNA测序确认正确的克隆，成功构建了HbBAM1的pGEX-4T-1和pET43.1a中的原核表达载体，分别命名为pGEX-HbBAM1和pET43-HbBAM1。构建完成的原核表达载体转化大肠表达菌种BL21（DE3），对HbBAM1进行诱导表达，其诱导条件为：IPTG浓度为0.5 mmol/L，16 ℃诱导20 h。

1.2.6 HbBAM1重组蛋白的酶活性分析 超声破碎经IPTG诱导BL21（DE3）菌，13 000 r/min，10 min高速离心，分离上清和沉淀，沉淀用和上清相同体积的无菌水重悬，10%聚丙烯胺浓度的SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。取约0.5 μg未经纯化pET43-HbBAM1重组蛋白，用于最适酶活性温度的测定，以及不同浓度氧化型谷胱甘肽和双氧水对酶活性的抑制实验。反应体系为100 μL，含100 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠（pH5.6），1%的可溶性淀粉，分别置于不同温度的水浴中，测定pET43-HbBAM1重组蛋白的最适酶活性温度。抑制剂实验：分别加入不同浓度的氧化剂，其它反应体系与酶活性温度测定相同，反应温度为35 ℃。所有酶反应均在冰上混匀后，置于相应温度的水浴中反应15 min，然后分别加入900 μL的麦芽糖显色溶液（1%的3，5-二硝基水杨酸，30%的酒石酸钾钠，0.4 N的NaOH）终止反应，最后于100 ℃反应5 min显色，测定吸光值OD520。

2 结果与分析

2.1 HbBAM1基因全长cDNA的克隆

经DNA测序验证，获得了HbBAM1基因全长cDNA序列，全长1 913 bp，其中编码区长1 752 bp，共编码583个氨基酸序列。与拟南芥的HbBAM1的氨基酸序列同源性为75.7%。用Mega7.0[16]对HbBAM1和拟南芥的9个HbBAM进行进化树分析，HbBAM1和AtBAM1同源性最高，归于一个亚类。应用在线预测软件ChloroP and TargetP[17-18]，ProtComp[19]通过分析HbBAM1编码的氨基酸序列，其N末端有1条叶绿体转运肽，HbBAM1定位于叶绿体中。

2.2 HbBAM1基因在不同组织和叶片不同发育时期中的表达分析

實时荧光定量PCR分析结果显示，HbBAM1基因主要在巴西橡胶树的雌花、雄花、叶片和种子中表达，在根中几乎不表达（图2）。HbBAM1基因在巴西橡胶树不同发育时期叶片中的表达分析结果表明，随叶片的发育进程其表达量不断增加，在淡绿期和稳定期叶片中表达量最高（图3）。在不同时间点叶片中的表达分析结果表明，HbBAM1基因在光合作用最强的上午10：00和下午16：00的表达量最大，而晚上20：00和22：00的表达量最小（图4）。

2.3 HbBAM1在大肠杆菌中的重组表达

原核表达载体pGEX-4T-1的GST标签和pET43.1a的NusA标签均能促进HbBAM1的可溶性表达，SDS-PAGE电泳结果显示，2种标签使得HbBAM1以可溶性表达（图5）。酶活性分析结果表明，GST-HbBAM1和NusA-HbBAM1重组蛋白均有较强的β-淀粉酶活性（结果未显示），因为NusA-HbBAM1的表达量相对较大，最适酶活性温度和抑制剂实验均使用该蛋白用于下一步的实验。HbBAM1的最适酶活性温度是35 ℃，在45 ℃只有5.5%的酶活性，在50 ℃时则完全检测不到酶活性（图6）。不同浓度的氧化剂-氧化型谷胱甘肽和双氧水均能抑制HbBAM1的酶活性，其中经20 mmol/L的氧化型谷胱甘肽和0.2%的双氧水处理，HbBAM1只有对照10%左右的酶活性（图7）。

3 讨论

HbBAM1的最适酶活性温度为35 ℃，而在50 ℃时就完全没有酶活性，与拟南芥的BAM1[10]和豌豆上胚轴中β-淀粉酶[20]的最适酶活性温度类似。而与长期淀粉储存器官中的β-淀粉酶差异很大，它们的最适酶活温度相对较高，大豆的β-淀粉酶为60 ℃[21]，甘薯的为53 ℃[22]，土豆的为55 ℃[23]。这可能与它们的细胞定位和功能不同有关。HbBAM1位于叶绿体，负责降解叶绿体内临时储存的淀粉，最适酶活性温度较低，如25 ℃时还有最大酶活性的71%，有利于在环境温度条件下达到较大的酶活性，从而利于淀粉的快速降解，及时参与对环境变化的应答。而大豆、土豆等长期淀粉储存器官中的β-淀粉酶最适酶活性温度相对较高，低温时的酶活性较低[21]，使得储存器官中淀粉缓慢降解，有利于种子和块茎中淀粉的长期保存。

在拟南芥中，AtBAM1基因在幼嫩叶片中只在气孔的保卫细胞中表达，到成熟叶片时，叶肉细胞才也会有AtBAM1基因的表达。橡胶树中HbBAM1基因也是随着叶片的发育，在叶片中的表达量逐渐增大，很可能也是由于成熟叶肉细胞中HbBAM1基因大量表达，使得HbBAM基因在叶片中总体表达量增加。

橡胶树HbBAM1的酶活性受到氧化型谷胱甘肽和双氧水的抑制，这与拟南芥的AtBAM1[6，11]类似。拟南芥中光合系统I保持硫氧还蛋白的还原状态，从而还原处于氧化状态的AtBAM1，使得AtBAM1只能在白天处于激活状态[11]。HbBAM1基因在白天的表达量明显高于晚上，说明HbBAM1主要在白天发挥其生物学功能。一天当中上午10：00和下午16：00的光照强度适中，橡胶树光合作用最强，这时HbBAM1基因的表达量也最高（图4），HbBAM1可能在光照适宜的条件下，调控气孔的打开，促进橡胶树的光合作用。而在光照最强的中午12：00和14：00时，HbBAM1基因的表达量相对较低，减少气孔的开发，降低光合作用和减少水分的蒸发，使得橡胶树能够更好的适应热带地区中午的高温环境。HbBAM1基因在晚上的表达量最低，其在晚上处于本底表达水平。

本研究从橡胶树中克隆了1个叶绿体型β-淀粉酶基因HbBAM1，确定了HbBAM1的最适酶活性温度及不同氧化剂对其抑制作用，并分析了HbBAM1基因在不同组织和在叶片中同一天的表达模式，为进一步研究其在橡胶树叶片中的生理功能奠定了良好基础。

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