魏罡　张欣　张智　王婧　刘洋　杨可心　吕歌　武天琪　高群

摘要[目的]优化超声波辅助酶法提取油茶籽壳色素的最佳工艺。[方法]以油茶籽壳为原材料，采用超声波辅助酶法提取油茶籽壳色素，以响应面试验优化其提取条件。[结果]最佳提取条件：加酶量为0.8%，液固比20：1（g：mL），超声提取时间15min，超声提取功率90w，超声提取温度60℃。在此条件下测得的吸光度为2.765。酶辅助超声波法提取油茶籽壳色素较酶法和超声波提取法油茶籽壳色素吸光度提高了1.8、1.5倍。[结论]该研究优化了超声波辅助酶法提取油茶籽壳色素最佳工艺条件，为油茶籽壳色素的综合开发利用提供科学依据。

关键词 油茶籽壳色素；超声波辅助酶法；响应面法

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-661I（2018）11-0004-06

油茶（CamelliaoleiferaAbel）为山茶科山茶属多年生木本油料作物，是我国最重要的食用油料树种之一，与油橄榄、油棕和椰子并称为世界四大木本食用油料树种。我国是世界上油茶品种最多、茶油籽产量最高的国家。油茶树的种子由油茶籽壳和籽仁组成，为多年生多次收获。油茶栽培在我国已有2000多年的历史，目前主要分布在湖南、江西、广西、福建、安徽、贵州、云南等省（区），在四川、陕西、江苏和台湾也有少量栽培。据统计，全国现有油茶栽培面积约300万hm²，年产油茶籽量约100万t，年产茶油约26万t，年产茶粕约68万t，总产值约110亿元。

油茶果榨油后废弃的籽粕提取的油茶籽壳色素，是具有巧克力样色泽的棕色素。目前，我国食用棕色素绝大部分从国外进口，且价格较高，而国内对于油茶籽壳的研究主要表现在制备糠醛、木糖醇和活性炭等方面，在油茶籽壳色素方面的研究较少。1993年刘晓庚分析了油茶副产物的成分及应用；1985年凌诚德开展了国产食用天然色素油茶果壳棕色素毒性试验，指出油茶果壳棕色素是安全性较高的可食用天然色素，但尚未见对该色素的提取及其他功能活性研究的报道。

采用酶提取法和超声波提取法从植物中提取天然色素的研究国内外已有较多报道，也有采用超声波辅助酶法从榛子壳、白玉兰、大枣皮、山楂皮等材料中提取天然植物色素，但以此方法提取油茶籽壳色素的研究鲜见报道。酶解反应具有高效性、专一性的特点，针对植物细胞壁的构成，选择相适应的酶溶解细胞壁，能够显著提高植物中有效成分的萃取；超声波萃取技术是通过快速的机械振动波引起的一系列物理和化学效应加速色素物质的溶出，有利于提高油茶籽壳色素得率。笔者以油茶籽壳为原材料，采用超声波协同酶法提取油茶籽壳色素，采用单因素和响应面试验进行优化得到最佳提取条件，实现工业化生产，旨在为油茶籽壳色素的综合开发利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料 油茶，重庆秀山县；纤维素酶（8000U/g），山东长泰生物科技有限公司；其他化学药品均购置于试剂公司。

1.2仪器 765MC紫外可见分光光度计，上海精密儀器厂；KQ3200DE型超声波数控清洗仪，昆山市超声仪器厂；pH计，奥立龙ThennoOrion，美国；ALC-110电子天平，上海天平仪器厂；DFT-100多功能粉碎机，大德机械总厂；DFC-6053型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；DK-98-IIA恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1油茶籽壳色素提取工艺流程。油茶籽壳→干燥→粉碎→称取1g油茶籽壳粉一加入提取溶剂20mL→酶解→超声波提取→抽滤→油茶籽壳色素粗提液→定容→稀释→测定吸光度。

1.3.2油茶籽壳色素最大吸收峰测定。称取1g油茶籽壳粉末加入20mL一定浓度的乙醇溶液，超声功率100w（温度50℃）提取10min，取上清液。稀释10倍后，在250～600nm处扫描，测定最大吸收波长。

1.3.3酶法提取油茶籽壳色素单因素试验。取1g油茶籽壳粉，加入提取溶剂，在其他提取条件一致的情况下，根据油茶籽壳色素在最大吸收峰处的吸光度，间接得到油茶籽壳色素的得率。分别考察缓冲溶液的pH（4.6、5.8、6.4、7.2、8.0）、酶解温度（30、40、50、60、70℃）、液固比[10：1、20：1、30：1、40：1、50：1（g：mL），下同]、加酶量（0.2%、0.8%、1.4%、2.0%、6.0%）、酶解时间（30、60、90、120、360min）5个单因素对油茶籽壳色素提取效果的影响。

1.3.4超声波辅助酶法提取油茶籽壳色素单因素试验。

1.3.4.1提取溶剂筛选。分别称取油茶籽壳粉末6份，每份1.0g，置于6支三角瓶中，分别加入20mL蒸馏水、石油醚、甲醇、丙酮、40%乙醇、60%乙醇；于60次/min往复振荡水浴锅提取24h后，测浸提液颜色，以颜色深者确定为提取溶剂。

1.3.4.2提取超声功率单因素试验。取1g油茶籽壳粉，在酶解提取因素最优的条件下，考察不同超声功率（70、80、90、100、120w）、不同超声温度（30、40、50、60、70℃）、不同超声时间（5、10、15、20、25min）3个单因素对油茶籽壳色素提取效果的影响。

1.3.5超声波辅助酶法提取色素响应面试验。依据Box—Behnken组合试验设计原理，以超声功率、超声温度、加酶量、液固比4个指标为考察对象，采用DesignExpert8.05响应面软件设计4因素3水平试验，优化油茶籽壳色素提取最优条件。响应面分析因素和水平见表1。

1.3.6不同方法提取油茶籽壳色素比较。在最优提取条件下，分别采用酶法、超声波法、酶辅助超声提取法提取油茶籽壳色素，在最大吸收峰处测定其吸光度。

2结果与分析

2.1油茶籽壳色素最大吸收峰的确定从图1可以看出，在波长250～600nm对油茶籽壳色素进行扫描，在波长267nm处吸光度最大，为最大吸收波长。因此，后续试验油茶籽壳色素吸光度的测定均在267nm波长下进行。

2.2酶法提取油茶籽壳色素的单因素试验

2.2.1pH对提取效果的影响。由图2可知，油茶籽壳色素在pH为4.6～5.8时，吸光度呈直线增加；在pH5.8时油茶籽壳色素的吸光度最大，为1.01；当pH继续增加时油茶籽壳色素的吸光度开始下降。这是因为在pH5.8时，酶能够发挥最大活力，超过最适范围后，细胞内化学环境不利于酶解作用，使酶活性降低。

2.2.2温度对提取效果的影响。由图3可知，温度在30～60℃时，酶解温度升高，油茶籽壳色素的吸光度也随之增加；60℃时油茶籽壳色素吸光度为1.23，达到最大；超过60℃后吸光度稍有降低。这是因为在酶解反应的适宜温度内，温度升高能够加快酶解速度，使色素快速溶出；超过最适酶解温度，酶活力降低。综合考虑，选择最佳提取温度为50℃。

2.2.3液固比对提取效果的影响。由图4可知，液固比在20：1之前，色素吸光度呈线性增加；20：1时油茶籽壳色素的吸光度达到峰值，为1.32；超過20：1时，油茶籽壳色素的吸光度降低，这是因为当超过最佳比值时，溶液增加酶的浓度降低，达不到最佳酶解效果。因此确定20：1为较适宜的酶解液固比。

2.2.4加酶量对提取效果的影响。由图5可知，加酶量为0.8%时，油茶籽壳色素的吸光度最大；当酶用量超过0.8%时，油茶籽壳色素的吸光度略有下降。这是因为酶用量在一定范围时，酶解速率与加酶量呈正相关，超过这一范围，油茶籽壳色素吸光度不再增加反而降低。因此，确定0.8%为较适宜的酶用量。

2.2.5酶解时间对提取效果的影响。由图6可知，酶解时间在30～120min，油茶籽壳色素的吸光度随酶解时间的增加而升高；酶解时间为120min时，油茶籽壳色素的吸光度达到最大，为1.06；超过此时间，油茶籽壳色素吸光度降低。因此，选择120min为较适宜的酶解时间。

2.3超声波辅助酶法提取油茶籽壳色素条件优化

2.3.1提取溶剂。不同提取溶剂对油茶籽壳色素的提取效果明显不同。通过浸提液颜色可以看出，油茶籽壳色素可溶于极性较大的溶剂中，不溶或难溶于非极性溶剂中，其中乙醇具有较强提取能力，提取液为深棕色或棕色，丙酮和甲醇有一定提取能力，提取液为浅黄色，非极性或极性较小的试剂如石油醚不能提取色素。通过浸提液颜色判断，60%乙醇提取的油茶籽壳溶液颜色最深，提取效果最好。

2.3.2提取功率。由图7可知，当提取功率为90w时，油茶籽壳色素的吸光度达到最大；超声功率超过90w时，油茶籽壳色素的吸光度随着功率的增加而降低。这里因为在超声功率较小时，组织破碎不完全导致色素未完全释放，功率太大会导致油茶籽壳色素因热量堆积而分解，致使结构破坏，从而使色素吸光度降低，不利于油茶籽壳色素的提取。综合考虑，选择最佳提取功率为90w。

2.3.3提取温度。由图8可知，温度在60℃之前，随着超声温度的升高油茶籽壳色素的吸光度迅速增加，其后随着超声温度的升高，吸光度下降。因此，较适宜的油茶籽壳色素超声提取温度为60℃。

2.3.4超声时间。由图9可知，超声时间在10min之前，油茶籽壳色素的吸光度直线增加，超声时间超过10min后，油茶籽壳色素吸光度下降。超声时间过短，色素未完全溶出；超声时间太长，色素由于长时间超声加热而分解，不利于油茶籽壳色素的提取，导致色素吸光度降低。因此，10min为色素超声提取的最佳时间。

2.4超声波辅助乙醇提取色素响应面试验

2.4.1响应面设计结果及回归模型方差分析。综合单因素试验，以加酶量（A）、超声温度（B）、超声功率（C）、液固比（D）为考察对象，采用SPSS19.0软件优化提取工艺条件。试验设计及结果见表3。以油茶籽壳色素吸光度为响应值，经回归拟合后，得到回归方程：吸光度=2.57+0.048A+0.032B-0.035C+0.050D-0.056AB-0.091AC-0.200AD+0.065BC+0.088BD+0.056CD-0.540A²-0.740B²-0.680C²-0.590D²。当P<0.05时代表参数具有显著影响，P<0.01时表示参数具有高度显著影响，在P<0.001表示参数具有极显著影响。该模型P<0.001表示极显著，且失拟项不显著（P>0.1），说明该模型构建成功，可以用此模型和方程来推测油茶籽壳色素的得率。

方差分析结果表明，模型中交互项（AD）、（BC）为差异显著影响因素（P<0.05）。二次项各因素中A²、B²、C²、D²为差异极显著影响因素（P<0.001）。失拟项（P=0.19）较小，表明该方程对试验拟合程度好，误差小，因此该模型成立。各因素对油茶籽壳色素吸光度影响由大到小依次为液固比（D）、加酶量（A）、超声温度（B）、超声功率（C）。

2.4.2响应面分析及提取工艺优化。图10～14可知，随着加酶量、超声温度、超声功率、液固比的增加，油茶籽壳色素吸光度均先增加达到峰值后下降，其中AD的交互作用最明显，BC的交互作用其次。

油茶籽壳色素的最佳提取条件：加酶量为0.8%，液固比20：1，超声提取时间15min，超声提取功率90W，超声提取温度60℃。油茶籽壳色素吸光度理论值为2.672。根据响应面结果进行验证性试验考察试验结果是否可行，重复5次后，验证油茶籽壳色素吸光度值平均值为2.765，与理论值的相对误差为3.4%，说明验证试验结果与回归方程预测值高度吻合，此提取工艺条件可靠性较高。

2.5不同方法提取油茶籽壳色素比较由图15可知，在最优条件下，纤维素酶法提取油茶籽壳色素吸光度为1.538，超声波提取油茶籽壳色素的吸光度为1.789，超声波辅助酶法提取油茶籽壳色素吸光度为2.765。由此可知，超声辅助酶法在最优条件下油茶籽壳色素提取效果优于酶法和超声波提取法。

3结论

（1）超声波辅助酶法提取方法可以显著提高油茶籽壳色素吸光度，在此最优条件下油茶籽壳色素吸光度为2.765，分别是单独酶法提取、超声波提取的1.8、1.5倍。

（2）超声波辅助酶法提取油茶籽壳色素最佳条件：加酶量为0.8%，液固比20：1，超声提取时间15min，超声提取功率90w，超声提取温度60℃。在此条件下测得的油茶籽壳色素的吸光度为2.765，与理论值的相对误差为3.4%。

科技论文写作规范——缩略语

采用国际上惯用的缩略语。如名词术语DNA（脱氧核糖核酸）、RNA（核糖核酸）、ATP（三磷酸腺苷）、ABA（脱落酸）、ADP（二磷酸腺苷）、CK（对照）、CV（变异系数）、CMS（细胞质雄性不育性）、IAA（吲哚乙酸）、LD（致死剂量）、NAR（净同化率）、PMC（花粉母细胞）、LAI（叶面积指数）、LSD（最小显著差）、RGR（相对生长率），单位名缩略语IRRI（国际水稻研究所）、FAO（联合国粮农组织）等。对于文中有些需要临时写成缩写的词（如表及图中由于篇幅关系以及文中经常出现的词而写起来又很长时），则可取各主要词首字母写成缩写，但需在第一次出现处写出全称，表及图中则用注解形式在下方注明，以便读者理解。