任雨贺　刘淑莹　万茜淋

摘要[目的]优选人参蛋白质提取的最佳方法，并比较不同生长年份对人参蛋白质含量的影响。[方法]比较丙酮沉淀法、聚乙二醇6000沉淀法、聚乙二醇20000沉淀法、酚提取法、Trizol提取法5种人参蛋白质的提取方法，及不同生长年份的人参蛋白质，采用Bradford方法测定蛋白质含量，SDS-PAGE电泳鉴定蛋白。[结果]丙酮提取法得到的蛋白质纯度最高，电泳条带最清晰完整，且人参蛋白质的含量随生长年份增加而升高。[结论]丙酮沉淀法是一种较好的适用于人参蛋白质提取的方法，5年生人参蛋白质含量最高。

关键词 人参蛋白；提取方法；SDS-PAGE电泳

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）11-0001-03

人参（Panax ginseng C.A.Mey）为五加科草本植物人参的干燥根和根茎，为我国的名贵中药材，被誉为“百草之王”，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效。现代药理研究表明，人参具有增强记忆力、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力、改善心血管等作用。人参中成分复杂，主要含有人参皂苷、多糖、氨基酸、多肽、蛋白质、有机酸、生物碱、黄酮、甾醇及木质素等化学成分，目前研究主要集中在人参皂苷上，其他成分的研究相对较少，尤其是其中的蛋白质成分。研究表明，人参蛋白质具有保护神经细胞、抗肿瘤、抗病毒等药理作用。

目前，提取人参蛋白质的方法主要有硫酸铵沉淀法、有机试剂沉淀法、膜过滤法、快速溶剂萃取法等，其中膜过滤法和快速溶剂萃取法需要特殊仪器，成本较高，而硫酸铵沉淀法操作过于繁琐。笔者以蛋白质提取率、纯度、电泳结果为考察指标，比较有机试剂沉淀法中的丙酮沉淀法、聚乙二醇6000沉淀法、聚乙二醇20000沉淀法，及借鉴其他植物根部蛋白质提取的酚提取法、Trizol提取法，以期对今后人参蛋白质的研究提供借鉴。

1材料与方法

1.1材料与试剂 人参：吉林省抚松县3、4、5年生生晒参。试剂：牛血清白蛋白（BSA）购于TIANGEN公司；考马斯亮蓝G250购于TIANGEN公司；低分子量标准蛋白Marker购于Solarbio公司；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备 超细小型中药粉碎机，永康市红太阳机电有限公司；磁力加热搅拌器，天津赛得利斯实验分析仪器制造厂；台式高速大容量离心机，eppendorf公司；FDU-1100真空冷冻干燥机，EYELA公司；酶标仪，TECAN公司；EP600电泳仪，上海天能公司；水浴恒温振荡器，上海百典仪器设备有限公司。

1.3不同蛋白质提取方法的比较

1.3.1有机试剂沉淀法。

1.3.1.1人参蛋白质粗提液的制备。取3年生生晒参若干，粉碎机粉碎，称取约6.0g粗粉，加入10倍量的10mmol/LTris-HCl（pH7.4）缓冲液搅拌均匀，在4℃下搅拌浸提18h。于4℃条件下，5000r/min离心30min，取上清液，于4℃保存。向沉淀中加入10倍量的10mmol/LTris-HCl（pH7.4），继续搅拌浸提18h。于上述相同条件离心，取上清液，与第一次上清液合并，混匀，平均分成3份。

1.3.1.2丙酮沉淀法。向其中1份人参蛋白质粗提液中加入1.5倍体积的丙酮，-20℃下静置过夜。于4℃条件下，5000r/min离心30min，弃去上清液，下层沉淀在-20℃下放置20min挥干丙酮，转移至-80℃过夜。冻干，蛋白干粉于-80℃储存备用。

1.3.1.3聚乙二醇6000沉淀法。向其中1份人参蛋白质粗提液中加入聚乙二醇6000，使其终浓度为20%，-20℃下静置过夜。于4℃条件下，5000r/min离心30min，弃去上清液，下层沉淀转移至-80℃过夜。冻干，蛋白干粉于-80℃储存备用。

1.3.1.4聚乙二醇20000沉淀法。向其中1份人参蛋白质粗提液中加入聚乙二醇20000，使其终浓度为20%，-20℃下静置过夜。于4℃条件下，5000r/min离心30min，弃去上清液，下层沉淀转移至-80℃過夜。冻干，蛋白干粉于-80℃储存备用。

1.3.2酚提取法。参照郭广芳等的小麦根蛋白提取方法，并略有改动。取3年生生晒参若干，粉碎机粉碎，称取约2.0g粗粉，液氮研磨充分后加入20mL提取液（蔗糖250.6mmoL/L，Tris—HCl20mmoL/L，EDTA10mmol/L，PMSF1mmoL/L，DTrlmmoL/L和TritonX-100400mmoL/L）研磨15min。于4℃条件下，12000r/min离心15min，取上清液，加入三氯乙酸（TCA）使其终浓度为10%，一20℃沉淀过夜。以上述条件离心，弃上清，沉淀用预冷的丙酮（含0.2%DTT）洗4次，转移至-80℃过夜。冻干，蛋白干粉于-80℃储存。

1.3.3Trizol提取法。参照Kirkland等的蛋白质提取方法，并略有改动。取3年生生晒参若干，粉碎机粉碎，称取约2.0g粗粉，液氮研磨充分后加入20mLTrizol溶液，充分混匀后，加入2mL氯仿，剧烈振荡15min，室内静置5min。于4℃条件下，12000r/min离心15min，弃上层水相，加入3mL95%乙醇，振荡混匀，离心取上清。上清液中加入4倍体积的异丙醇沉淀2～3h，离心，沉淀用20mL含0.3mol/L盐酸胍的95%乙醇溶液洗3次。室温放置20min，然后用95%乙醇洗2次。于4℃条件下，7000r/min离心10min，沉淀转移至-80℃过夜。冻干，蛋白干粉于-80℃储存。

1.4不同年份人参蛋白质含量的比较

1.4.1蛋白质粗提液的制备。采用“1.3.1.1”方法分别提取3、4、5年生生晒参蛋白质粗提液。

1.4.2不同年份人参蛋白质的提取。采用“1.3.1.2”丙酮沉淀法，分别提取3、4、5年生生晒参的蛋白质。

1.5蛋白质定量

1.5.1标准曲线的绘制。将0、2、4、6、8、10、12、14μL牛血清白蛋白（BSA）标准溶液（1mg/mL）分别加入到96孔板中，加入PBS溶液补足至20μL，分别向各孔中加入180μL考马斯亮蓝G250染液，混匀。用酶标仪在595nm处测定吸光度（A），以不含BSA的样品吸光度为空白对照，以蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5.2人参蛋白质含量测定。取不同提取方法的人参蛋白干粉分别配制成10mg/mL溶液，取2μL此溶液于96孔板中，加入18μLPBS溶液、180μL考马斯亮蓝G250染液，混匀，用酶标仪在595nm波长处测定吸光度（A），每个样品做3次平行，测定人参蛋白质含量，计算提取率及纯度。

提取率=总蛋白质量/人参粗粉质量×100%

纯度=总蛋白质量/蛋白粗粉质量×100%

1.6SDS-PAGE电泳

1.6.1蛋白样品制备。分别称取不同提取方法提取的蛋白干粉约10.0mg，加入1mLPBS缓冲溶液使之溶解。取40μL样品溶解液，加10μL5×蛋白上样缓冲液，沸水中煮5min，置于冰上备用。

1.6.2凝胶灌制及电泳过程。按所需试剂比例，分别配制15%分离胶溶液和5%浓缩胶溶液。加入TEMED后，立即快速混匀，并迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间，用少量异丙醇封层。待分离胶聚合完全后（约30min），倾出封层液体，并用滤纸条擦干。在已聚合的分离胶上层灌注加入TEMED后的浓缩胶，立即在浓缩胶中插入干净的Teflon梳子，避免进入气泡。当浓缩胶聚合完全后（约30min），小心移出Teflon梳子，将凝胶固定于电泳装置上，内外槽各加入电泳缓冲液，按预定顺序上样，每个样品20μL。接上电源，调节电压，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，待样品迁移至凝胶边缘处即可停止。

1.6.3凝胶染色及脱色。在甲醇：水：乙酸=50：40：10的混合溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250，过滤去除沉淀，用染色液浸泡凝胶，置于水浴恒温振荡器上平缓振荡30min。将凝胶浸泡于不加染料的脱色液中，于水浴恒温振荡器上振荡，每2h更换一次脱色液，更换3～4次，直至背景清晰。

2结果与分析

2.1不同提取方法对人参蛋白质含量的影响

2.1.1标准曲线。蛋白定量标准曲线见图1。曲线方程y=0.0702x+0.0238，R²=0.9957，说明此曲线方程可用于计算蛋白质含量。

2.1.2不同提取方法对人参蛋白质提取率及纯度的影响。由图2可知，聚乙二醇20000沉淀法提取得到的人参蛋白质提取率最高，为8.53%；而丙酮沉淀法提取得到的人参蛋白质纯度最高，为61.05%。结合冻干后蛋白干粉的状态，初步认为聚乙二醇20000沉淀法提取的人参蛋白质中残留有机溶剂较多，且不易去除，导致所提取蛋白质纯度较低。而酚提取法及Trizol提取法得到的人参蛋白干粉复溶性极差，基本不溶，因此提取率及純度均极低。丙酮提取法得到的蛋白质也存在复溶性不好的问题，认为可能与丙酮挥干有关，可考虑延长挥干时间，以得到最佳的人参蛋白质提取方法。

2.1.3不同提取方法对人参蛋白质SDS-PAGE电泳的影响。由图3可知，人参蛋白质分子量主要分布在15～70kD，主要包括分子量约为64、29、27、21、18、15kD的蛋白质，其中分子量27、29kD为主要蛋白质。丙酮沉淀法提取的人参蛋白质条带最完整清晰，聚乙二醇20000沉淀法蛋白质电泳条带上方出现大量空白，推测是其中残留有机试剂较多，且与电泳凝胶发生反应。酚提取和Trlzol提取法提取的人参蛋白质因其复溶性极差，电泳条带也较浅。

2.2不同生长年份对人参蛋白质含量的影响

2.2.1不同生长年份对人参蛋白质提取率及纯度的影响。由图4可知，5年生生晒参人参蛋白质的提取率最高，为3.67%，且其提取得到的人参蛋白质纯度也最高，为86.80%。这表明不同生长年份对人参蛋白质含量有一定影响，且生长年份越长，其蛋白质含量越高。

2.2.2不同生长年份对人参蛋白质SDS-PAGE电泳的影响。由图5可知，3、4、5年生人参蛋白质相比，其人参蛋白质种类并无变化，但5年生蛋白质含量明显升高，尤其是分子量为29、27kD的蛋白质含量增加较多。这表明不同生长年份对人参蛋白质含量有一定影响，且随着年份增长蛋白质含量逐渐升高。

3结论与讨论

蛋白质是生命活动的物质基础，是人类生命活动不可缺少的营养物质。植物蛋白一般分为2类：一类是完全蛋白，如大豆蛋白；另一类是不完全蛋白，绝大多数的植物蛋白属于此类。但因蛋白质的结构复杂，物理和化学性质不稳定，因此在植物蛋白质提取过程中要综合考虑各种因素对其的影响。该研究对几种不同人参蛋白质提取方法进行了对比，其中酚提取法是参考小麦根部蛋白质提取方法优化，Trlzol提取法是参考嗜盐蛋白质的提取方法优化，而2种提取方法得到的蛋白质复溶性均较差，均不适用于人参蛋白质的提取。聚乙二醇20000沉淀法得到的人参蛋白质提取率最高，但其纯度较低，推测是其中残留有机试剂较多，并与电泳凝胶反应，且无法确定其含量及毒性，因此不是提取人参蛋白质的最佳方法；丙酮沉淀法虽然提取率不是最高，但其纯度较高，提取过程中丙酮成分可以通过挥干的方法去除，且其电泳条带最清晰完整。综合考虑，人参蛋白质的最佳提取方法为丙酮沉淀法。

该研究采用丙酮提取法分别提取了3、4、5年生人参蛋白质，并进行了蛋白质含量的比较。结果发现，3年生人参蛋白质含量最低，4年生人参蛋白质含量居中，而5年生人参蛋白质含量最高，分子量27、29kD的蛋白质含量增多最明显。经查阅文献，分子量为27、29kD的人参蛋白质属核糖核酸酶类，具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。

综上所述，经过上述5种植物蛋白质提取方法比较得出，丙酮沉淀法是一种较好的适用于人参蛋白质提取的方法。经过对不同生长年份人参蛋白质的对比，人参生长年份对其蛋白质含量有一定影响，随着生长年份的增加，人参蛋白质含量逐渐升高，即3年生人参蛋白质含量最低，5年生人参蛋白质含量最高。