章淑玲 林谷园 肖顺

摘要 花生茎线虫Ditylenchus arachis是危害花生的重要病原线虫。本研究通过测试不同真菌和培养温度对花生茎线虫繁殖力的影响，以探讨该线虫在室内的培养条件。研究结果表明：花生茎线虫在长柄链格孢、茄镰孢、尖镰孢和灰葡萄孢上均能完成生活史并进行繁殖，但不同真菌上培养线虫的效果不同。其中长柄链格孢的培养效果最好，培养30 d后的总虫量和繁殖系数分别为37 292条和1 243倍；灰葡萄孢的培养效果最差，30 d后的总虫量和繁殖系数仅为1 514条和50倍。25～30℃是花生茎线虫的适宜培养温度，30℃时为最佳温度；当温度低于20℃或高于35℃时线虫繁殖效果差。此方法繁殖的线虫可用于花生茎线虫生物学、遗传学等方面的研究。

关键词 花生茎线虫； 真菌； 温度； 繁殖力

中图分类号： S435.652

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017288

Abstract Ditylenchus arachis is one of the important damaging nematodes of peanut in China. In order to study the cultural conditions on fungi in the laboratory， the effects of different fungi and different cultural temperatures on the reproductive capability of D.arachis were evaluated. The results showed that D.arachis could complete its life cycle and reproduce on Alternaria longipes， Fusarium solani， F. oxysporum and Botrytis cinerea， but the effects of different fungi varied. The reproductive capability of D.arachis was the highest on A.longipes， with a total number of nematodes and reproduction rate of 37 292 and 1 243， respectively. The total number of nematodes and reproduction rate were the lowest on B.cinerea （only 1 514 and 50， respectively）. The optimum temperatures for D.arachis on fungi were from 25℃ to 30℃， and 30℃ was the best cultural temperature. D.arachis could not reproduce well at temperatures lower than 20℃ or greater than 35℃. D.arachis cultured by this method can be used for biological and genetic studies on this nematode.

Key words Ditylenchus arachis； fungus； temperature； reproduction capability

花生莖线虫病于1987年在南非的德兰士瓦省（Transvaal）的花生荚果上首次发现，其后在南非所有的花生主产区普遍发生，受侵染的花生通常减产20%～50%，是南非花生上最重要的线虫病害，病原经鉴定为非洲茎线虫Ditylenchus africanus[14]。2014年本实验室在我国山东、河北两省的多个花生主产区首次发现了花生茎线虫病害，病原经形态学、分子生物学及致病性测定，确定为一种茎线虫新种——花生茎线虫Ditylenchus arachis[5]。该线虫可侵染花生的根系、胚栓、果荚和种粒，致使受害后的花生根系减少、腐烂，结荚少，固氮根瘤菌减少，果荚外壳变黑、腐烂，种皮褐变、皱缩，严重降低了花生的产量和品质[56]。因此，花生茎线虫是继根结线虫Meloidogyne spp.后又一个对中国花生生产造成重要影响的病原线虫[7]。为了进一步研究该线虫的生物学、致病机理、种群间的遗传特性及防治技术，需要快速获得大量的、具有较强生命力的病原线虫群体。目前常用于线虫培养的方法有寄主接种法、离体组织培养法和真菌培养法等[8]。本研究采用真菌培养线虫的方法，分别测试不同真菌和培养温度对花生茎线虫繁殖力的影响，以探讨花生茎线虫人工培养的最适条件。

1 材料与方法

1.1 材料来源

供试的花生茎线虫6个地理种群（编号Dar01～Dar06）分别来自河北邢台、河北迁安、山东莱芜、山东费县、山东聊城和江苏宿州的花生茎线虫病果荚，病果荚中的茎线虫经改良贝尔曼漏斗法分离取得[9]。

供试的长柄链格孢Alternaria longipes、尖镰孢Fusarium oxysporum、茄镰孢F. solani及灰葡萄孢 Botrytis cinerea采用组织分离法从福建的烟草、香蕉、山药及番茄上分离获得[10]。

1.2 线虫的消毒

分离出的线虫悬浮液经沉降后收集于1.5 mL eppendorf管中，3 000 r/min离心2 min，去上清液；加入0.1%硫酸链霉素溶液，进行表面消毒10 min；再用无菌水清洗2～3次，备用。

1.3 真菌培养基的制备

PDA试管斜面的制备：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

在超净工作台内将不同真菌分别接种于灭菌后的PDA斜面试管中，置于28℃的恒温培养箱中培养5～7 d，待用。

1.4 真菌培养花生茎线虫

1.4.1 不同真菌对花生茎线虫培养的影响

分别吸取已消毒并清洗的30条河北邢台花生茎线虫（Dar01）雌虫接种到长满真菌的PDA斜面试管中，每种菌设20个重复，置于28℃的恒温培养箱中进行黑暗培养30 d。30 d后分离计数试管中培养的花生茎线虫数。

1.4.2 不同培养温度对花生茎线虫的影响

挑取已消毒并清洗的30条河北省邢台花生茎线虫（Dar01）雌虫接种于长满长柄链格孢的PDA斜面试管中，分别置于15、20、25、30℃和35℃的恒温黑暗培养箱中培养30 d，每处理设20个重复，测定不同培养温度下花生茎线虫的繁殖力。

1.4.3 不同地理种群间花生茎线虫的繁殖力测定

分别挑取已消毒并清洗的30条6个不同地理种群的花生茎线虫，按1.4.1的方法接种于长满长柄链格孢的PDA斜面试管中，每个地理种群设20个重复。培养30 d后分离计数其中的花生茎线虫数。

1.5 线虫的分离与统计

往培养到期的真菌斜面试管中加入无菌水进行反复冲洗，将试管壁及真菌中的花生莖线虫尽可能地洗出。洗出的线虫悬浮液经沉降后收集到10 mL的离心管中，3 000 r/min离心2 min，最后定容至1 mL。用100 μL移液管吸取20 μL线虫悬浮液于载玻片上，在体视显微镜下分别统计卵、幼虫、雄虫、雌虫的数量，重复3次取平均值。最后根据定容的体积计算出每个接种重复的总虫数。线虫的繁殖系数（Rr）=最终线虫量（Pf）/起始线虫量（Pi）。

1.6 数据分析

采用SPSS PASW Statistics v18.0 软件对获得的数据进行方差分析，并采用Duncan氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同种类的真菌对花生茎线虫繁殖力的影响

从图1可看出，花生茎线虫（Dar01）接种于4种不同真菌于28℃黑暗培养30 d后，均可见斜面试管中的菌丝相比接种前（图1a，c，e，g）已被线虫大量取食（图1b，d，f，h），用体视显微镜观察可见试管壁上有大量的线虫团（图1i），说明供试的4种真菌均可用于花生茎线虫的人工室内培养。但在不同种类真菌上花生茎线虫的繁殖力表现出显著的差异（表1）：花生茎线虫在长柄链格孢上培养的效果最好，30 d后各虫态数量分别为卵704个、幼虫34 592条、雌虫972条、雄虫1 024条，虫口总数达37 292条，繁殖系数为1 243倍；其次是茄镰孢和尖镰孢，其繁殖系数分别为541倍和429倍；灰葡萄孢培养的效果最差，30 d后花生茎线虫的总虫数仅1 514条，繁殖系数为50倍，与以上3种真菌的繁殖力存在显著差异。

2.2 不同培养温度对花生茎线虫繁殖力的影响

从表2可以看出，温度对花生茎线虫在长柄链格孢上的繁殖有很大的影响。15℃下培养30 d后虽可见少数幼虫和雄虫，但卵和雌虫的数量为0，说明当温度≤15℃时花生茎线虫不能顺利地完成生活史。在25～30℃的培养温度之间，随着温度的升高，花生茎线虫的幼虫、成虫数量在不断增加，说明其繁殖力在不断地升高，尤其当温度达到30℃时花生茎线虫的总数达到了最高值43 120条，繁殖系数也达到了1 437倍，说明30℃是花生茎线虫繁殖的最佳温度。温度高于30℃后花生茎线虫的繁殖能力随之下降，当温度升高到35℃时，花生茎线虫的繁殖力与15℃和20℃时差异不显著。

2.3 不同地理种群间花生茎线虫的繁殖力测定

将6个不同地理种群的花生茎线虫各30条接种于长柄链格孢上，于28℃的恒温培养箱中黑暗培养，从表3可以看出，30 d后各个地理种群都能成功繁殖并顺利完成生活史，6个地理种群的花生茎线虫在各个不同虫态上发育数量虽存在一定差异，但其总虫数及其繁殖系数不存在显著差异。

3 结论与讨论

茎线虫属线虫是一类十分重要的植物寄生线虫，其中的多个种已被证实对作物造成了重大的危害，如腐烂茎线虫D.destructor、鳞球茎茎线虫D.dipsaci、巨大茎线虫D.gigas、水稻茎线虫D.angustus和非洲茎线虫D.africanus[34， 1113]。花生茎线虫D. arachis是在我国花生生产上发现的重要新病原。本试验首次探讨花生茎线虫在真菌上的培养条件，以此快速获取大量线虫样本，为后续开展花生茎线虫的相关特征研究提供基础保障。

本研究结果表明，花生茎线虫在长柄链格孢、茄镰孢、尖镰孢和灰葡萄孢这4种真菌上均能完成各自的生活史并进行有效的繁殖。但在不同种类真菌上的培养效果有较大的差异，其中在长柄链格孢上繁殖的效果最好，最适合用于花生茎线虫的大量快速培养，同时该菌也可用于腐烂茎线虫D.destructor和水稻干尖线虫Aphelenchoides besseyi的大量培养[1415]；其次是茄镰孢和尖镰孢；灰葡萄孢作为常用的线虫培养菌[1618]在本研究中的培养效果最差，其原因是否为该分离菌株存在分化变异还有待进一步研究。不同的培养温度对花生茎线虫的繁殖同样有较大的影响，30℃是真菌培养花生茎线虫的最佳温度，温度低于20℃或高于35℃都不利于该线虫的繁殖。不同地理种群的花生茎线虫在繁殖力上不存在显著差异，这可能也说明我国花生茎线虫在种群间比较保守而不存在明显的地理变异，这一研究结果对今后进一步研究花生茎线虫的种群遗传多样性有一定的参考价值。

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（责任编辑：田 喆）