李仲均，黄丽姗，黄素然

(南方医科大学附属东莞人民医院妇产科，广东 东莞 523059)

子痫前期是妊娠期特有的疾病，以妊娠20周后出现高血压、蛋白尿为主要特征。在西方发达国家发病率约为2%～8%[1]，在我国发病率约为9.4%～10.4%[2]。子痫前期是导致孕产妇和新生儿患病率和死亡率升高的重要原因之一。在全球范围内，每年约有5万例孕产妇死于该疾病及其并发症[3]。子痫前期的病因和发病机制目前尚未完全阐明，可能涉及遗传易感性、营养缺乏、血管内皮损伤、炎症免疫过度激活等多种因素[4]。其中血管内皮损伤，被认为是导致子痫前期发生和发展的重要因素[5]。半乳糖凝集素-1(Galectin-1)属于β-半乳糖苷结合蛋白家族成员，具有促进细胞生长、抑制细胞凋亡、介导细胞黏附等多种生物学功能[6]。近年的研究[7]表明，Galectin-1在参与调控细胞分化、新生血管形成、肿瘤侵袭和转移等过程中起重要作用。Galectin-1在子痫前期疾病过程中的作用少见报道。本研究通半定量反转录-聚合酶链反应(SqRT-PCR)法、免疫组织化学SP法检测Galectin-1在子痫前期患者胎盘组织中的表达，探讨其与子痫前期疾病发生的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月至2015年9月在南方医科大学附属东莞人民医院住院分娩的子痫前期患者40例，均符合子痫前期的诊断标准[2]，其中轻度子痫前期(轻度组)25例，年龄(27.3±3.6)岁，孕次(2.3±1.2)次，孕周(28.2±1.2)周；重度子痫前期(重度组)15例，年龄(29.2±3.2)岁，孕次(2.1±1.6)次，孕周(28.5±1.3)周。选择同期在本院住院分娩的正常妊娠孕妇(正常对照组)40例，年龄(29.1±4.5)岁，孕次(2.2±1.3)次，孕周(29.3±3.5)周。均无高血压、糖尿病、肾病，以及其他产科并发症。3组年龄、孕次、孕周比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器

山羊抗人Galectin-1多克隆抗体购自美国Abcam公司，小鼠抗人CD34单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，EnVisionTM+System购自丹麦DAKO公司，RNAiso Plus、Taq酶均购自宝生物工程(大连)有限公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自立陶宛Fermentas公司。CO2培养箱购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(型号：Forma3110)，光学显微镜购自奥林巴斯(中国)有限公司(型号：BX51)，凝胶成像系统购自美国伯乐公司(型号：Bio-Rad ChemiDoc MP)。

1.3 研究方法

1.3.1 标本采集

胎盘娩出后10 min内取材，即从近脐带附着处切取胎盘全层组织2块，每块组织大小为1 cm×1 cm×0.2 cm。用预冷的灭菌0.9%氯化钠注射液快速冲洗3次，去除血污，其中1块组织用灭菌滤纸吸去水分，装入1.5 mL的EP管中，放置-80 ℃ 冰箱保存；另1块组织放入10%中性甲醛中固定24 h，经乙醇梯度脱水，二甲苯透明浸蜡后，石蜡包埋成块，备用。

1.3.2 SqRT-PCR法检测胎盘组织中Galectin-1 mRNA的表达水平

将超低温冻结的胎盘组织标本称取50 mg，迅速置于用液氮预冷过的研钵中，在液氮中反复研磨至粉末，加入RNAiso Plus进行组织总RNA提取。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。建立PCR反应体系：Template DNA 1 μL，Forward primer(10 mmol·L-1)1 μL，Reverse primer(10 mmol·L-1)1 μL，PCR Master Mix(2×)10 μL，nuclease-free water 7 μL。PCR反应条件：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性1 min，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共30个循环，72 ℃ 延伸10 min。PCR引物(PCR引物由上海英骏生物有限公司合成)：Galectin-1[5′-CTGAACCTGGGCAAAGACAG-3′(上游引物)，5′-GCGGTTGGGGAACTTGAATT-3′(下游引物)]、β-actin[5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′(上游引物)，5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(下游引物)]。PCR扩增产物使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，GelRed染色，凝胶成像系统分析结果。以Galectin-1/β-actin比值代表Galectin-1 mRNA的表达水平。

1.3.3 免疫组织化学SP法检测胎盘组织中Galectin-1的表达

将石蜡包埋成块的胎盘组织3 μm连续切片，常规脱蜡、水化并进行抗原修复。滴加3% H2O2室温孵育10 min，再加入山羊抗人Galectin-1多克隆抗体(1:250稀释)和小鼠抗人CD34单克隆抗体(即用型)，4 ℃、5%CO2培养箱孵育过夜。PBS漂洗10 min，加入HRP标记二抗，37 ℃、5%CO2培养箱孵育30 min，DAB显色，苏木精-伊红染色(HE染色)，常规脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判读由2名经验丰富的病理科医师采用双盲法进行阅片。按文献[8]的评分方法，再按阳性细胞所占百分比(无阳性细胞数为0分，阳性细胞数<10%为1分，阳性细胞数10%～50%为2分，阳性细胞数51%～80%为3分，阳性细胞数>80%为4分)和染色强弱(无为0分，弱为1分，中为2分，强为3分)的乘积进行免疫反应评分(IRS)，按照评分的分值判断为阴性(0～3分)，阳性(弱+中+强，4～12分)。

1.3.4 胎盘组织中微血管密度的检测

参照文献[9]的方法，进行微血管密度计数：以CD34抗体标记血管内皮细胞，由2位经验丰富的病理科医师采用双盲法进行阅片，在光学显微镜(40倍)下选取微血管密度最高的区域，然后在光学显微镜(400倍)下观察5个不重复的视野，单个内皮细胞着色亦作为1个计数单位，但直径>100 μm的血管予以剔除。计算每个视野内微血管的数目，取平均数作为微血管密度值。

1.4 统计学方法

2 结果

半定量RT-PCR结果显示，胎盘组织中Galectin-1 mRNA表达水平：正常对照组为0.131±0.029，轻度组为0.381±0.039，重度组为0.662±0.045。轻度组、重度组胎盘组织中Galectin-1 mRNA表达水平均明显高于正常对照组，重度组胎盘组织中Galectin-1 mRNA表达水平明显高于轻度组，均P<0.05。见图1—2。

轻度组、重度组胎盘组织中Galectin-1阳性表达率均明显高于正常对照组，重度组胎盘组织中Galectin-1阳性表达率均明显高于轻度组，均P<0.05。见表1。

免疫组织化学结果显示，Galectin-1主要表达于胎盘滋养细胞的胞质和细胞膜。见图3封三。

表1 各组胎盘组织中Galectin-1表达率的比较

胎盘组织中微血管密度值：重度组为36.25±9.25，轻度组为52.13±6.35。重度组胎盘组织中微血管密度值明显低于轻度组(P<0.05)。子痫前期胎盘组织中Galectin-1 mRNA表达水平与微血管密度值呈负相关(r=-0.416 3，P<0.05)。

3 讨论

子痫前期是严重危害母婴健康的产科并发症，对其发病机制的研究一直是产科领域的热点。目前，有研究[10]认为，子痫前期的发生、发展是一个涉及母体、胎盘、胎儿等众多因素的复杂病理过程。遗传、免疫、环境等因素致滋养细胞功能障碍，滋养细胞浸润过浅，子宫螺旋动脉重铸不足，绒毛间质微血管形成减少，进而引起胎盘缺血、缺氧，其是子痫前期发病的始动因素。胎盘缺血、缺氧加重细胞损伤，释放多种胎盘因子进入母体血液循环、促使炎症免疫过度激活和血管内皮损伤是子痫前期发病的中心环节。Galectin-1属于动物凝集素家族成员，由LGALS1基因编码，定位于22q13.1染色体[11]。Galectin-1广泛表达于哺乳动物上皮细胞和免疫细胞的胞质和细胞膜中，可与层粘连蛋白、整合素β1亚基、细胞外基质等多种靶分子结合，发挥调节细胞生长、凋亡、黏附及炎症免疫反应等作用。随着研究的深入，Galectin-1在参与调控肿瘤发生、血管生成、免疫耐受等过程中的作用受到越来越多的关注[12-13]。

目前，有研究[14]发现，Galectin-1除了在胸腺、肾脏以及结直肠癌等恶性肿瘤组织中有较强表达外，在分泌期子宫内膜和蜕膜组织中也有一定丰度的表达。Tirado González等[15]采用ELISA法检测早、中、晚3个不同妊娠阶段共70例孕妇血清中Galectin-1的表达水平，发现自妊娠早期开始，孕妇外周血中Galectin-1表达水平升高，于妊娠中期到达最高峰，并维持这种高水平表达至妊娠晚期。进一步研究证实，Galectin-1最早出现在卵裂期和囊胚期等胚胎发育阶段并普遍表达于妊娠早期和晚期各型滋养细胞中。Freitag等[16]研究发现，外源性注入Galectin-1能够改变小鼠胚胎在着床过程中因血管生成受阻，而导致发育停止。笔者通过SqRT-PCR法、免疫组织化学SP法检测Galectin-1在子痫前期患者胎盘组织中的表达，结果显示，轻度组、重度组胎盘组织中Galectin-1 mRNA表达水平、Galectin-1阳性表达率均明显高于正常对照组(均P<0.05)，子痫前期胎盘组织中Galectin-1 mRNA表达水平与微血管密度值呈负相关(r=-0.416 3，P<0.05)，提示Galectin-1可能通过调控胎盘微血管生成参与子痫前期的病理过程。

参考文献：

[1] Steegers E A,von Dadelszen P,Duvekot J J,et al.Pre-eclampsia[J].Lancet,2010,376(9741):631-644.

[2] 乐杰.妇产科学[M].7版.北京:人民卫生出版社,2012:92-101.

[3] Ghulmiyyah L,Sibai B.Maternal mortality from preeclampsia/eclampsia[J].Semin Perinatol,2012,36(1):56-59.

[4] Williamson R D，O’Keeffe G W，Kenny L C.Activin signalling and pre-eclampsia:from genetic risk to pre-symptomatic biomarker[J].Cytokine，2015，71(2)：360-365.

[5] Boeldt D S，Bird I M.Vascular adaptation in pregnancy and endothelial dysfunction in preeclampsia[J].J Endocrinol，2017，232(1)：R27-R44.

[6] Thijssen V L，Griffioen A W.Galectin-1 and-9 in angiogenesis：a sweet couple[J].Glycobiology，2014，24(10)：915-920.

[7] Blanchard H，Bum Erdene K，Bohari M H，et al.Galectin-1 inhibitors and their potential therapeutic applications：a patent review[J].Expert Opin Ther Pat，2016，26(5)：537-554.

[8] Specht E，Kaemmerer D，Sänger J，et al.Comparison of immunoreactive score，HER2/neu score and H score for the immunohistochemical evaluation of somatostatin receptors in bronchopulmonary neuroendocrine neoplasms[J].Histopathology，2015，67(3)：368-377.

[9] Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors[J].Breast Cancer Res Treat，1995，36(2)：169-180.

[10] Méhats C，Miralles F，Vaiman D.New perspectives on preeclampsia[J].Med Sci(Paris)，2017，33(12)：1079-1088.

[11] Kaltner H，Toegel S，Caballero G G，et al.Galectins：their network and roles in immunity/tumor growth control[J].Histochem Cell Biol，2017，147(2)：239-256.

[12] Barrientos G，Freitag N，Tirado González I，et al.Involvement of galectin-1 in reproduction：past，present and future[J].Hum Reprod Update，2014，20(2)：175-193.

[13] Bacigalupo M L，Carabias P，Troncoso M F.Contribution of galectin-1，a glycan-binding protein，to gastrointestinal tumor progression[J].World J Gastroenterol，2017，23(29)：5266-5281.

[14] Blois S M，Conrad M L，Freitag N，et al.Galectins in angiogenesis:consequences for gestation[J].J Reprod Immunol，2015，108：33-41.

[15] Tirado González I，Freitag N，Barrientos G，et al.Galectin-1 influences trophoblast immune evasion and emerges as a predictive factor for the outcome of pregnancy[J].Mol Hum Reprod，2013，19(1)：43-53.

[16] Freitag N，Tirado González I，Barrientos G，et al.Interfering with Gal-1-mediated angiogenesis contributes to the pathogenesis of preeclampsia[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110(28)：11451-11456.