刘犀灵，任发政，2，雷新根，3，侯彩云，2

(1北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2中国农业大学食品科学与营养工程学院/食品质量安全北京实验室，北京 100083；3美国康奈尔大学动物科学系，纽约 14853)

糖尿病是一种与胰岛素分泌障碍及能量代谢紊乱相关的慢性疾病[1-3]。茶叶中含有丰富的活性物质，具有抗氧化[4]、预防肥胖[5]、增强免疫[6]等多种功效，其降血糖作用及机理被广泛报道[7]。作为具有芽型茶和叶型茶的白茶[8-9]，却缺少相关的研究。因此，本研究选取芽型茶白毫银针、芽叶型茶白牡丹及多叶型茶寿眉三种白茶作为研究对象，并以多叶型茶类黄大茶作为对照，构建诱发性糖尿病小鼠模型，对此4种茶叶水提物(TWEs)的降血糖效果进行评价，并进一步探究作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白毫银针、白牡丹、寿眉及黄大茶，购于北京市马连道茶城。SPF级雄性4w龄ICR小鼠，许可证号SCXK(京)2016-0011，北京维通利华实验动物技术有限公司；40%脂肪供能高脂高糖饲料及小鼠维持饲料，上海普路腾生物科技有限公司；链脲霉菌素(Streptozotocin，STZ)，美国Sigma公司；盐酸二甲双胍，北京协和药厂；Trizol试剂，碧云天生物科技有限公司；反转录试剂盒(5X All-In-One RT Master)，美国abm公司；实时荧光定量试剂盒(EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye)，美国abm公司；小鼠内参引物GAPDH，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004分析天平；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱；SHZ-III循环水真空泵；RE-52AA真空旋转蒸发仪；真空冷冻干燥机；Roche血糖仪活力型；Chemray 240全自动生化分析仪；DY89—II电动玻璃匀浆器；Epoch酶标检测仪；JY92—IIn超声细胞粉碎机；Thermofisher Nanodrop 2000核酸蛋白检测仪；Biometra T-personal 梯度PCR仪；Roche lightcycler 96荧光定量PCR仪；Eppendorf 54180R低温超速离心机等。

1.3 方法

1.3.1 茶叶水提物的制备与成分分析 将茶叶用粉碎后过40目筛备用，准确称取粉碎茶样，按1∶15的茶水比，80～90℃水浴浸提1h，过滤后将滤渣用同样方法浸提，合并两次滤液，55℃旋转蒸发浓缩滤液，将浓缩液真空冷冻干燥，得到白毫银针水提物(TWE-YZ)、白牡丹水提物(TWE-MD)、寿眉水提物(TWE-SM)和黄大茶水提物(TWE-HC)，密封包装，4℃保存备用[10]。采用福林酚法测定TWEs茶多酚总量[11]、蒽酮—硫酸比色法测定TWEs茶多糖含量[12]、三氯化铝比色法测定TWEs总黄酮[13]。

1.3.2 构造糖尿病模型与分组 购买小鼠于屏障环境动物房(温度22±2℃、湿度50%±5%、压差20～50Pa、12/12h光暗循环)，适应性喂养7d后，随机选取10只作为正常对照组(NC)喂养维持饲料，其余换成高脂高糖饲料，连续喂养4w后，隔夜禁食12h，将STZ溶解于pH 4.2～4.5的柠檬酸盐缓冲液，给小鼠腹腔注射STZ 110mg/kg·BW，1w之后测定血糖，空腹血糖(FBG)≥11.1mmol/L，造模成功[14]。并按照FBG随机分组为模型对照组(MC)、阳性对照组(PC)、TWE-YZ干预组、TWE-MD干预组、TWE-SM干预组、TWE-HC干预组，每组10只小鼠。

1.3.3 剂量设计 茶叶人体推荐剂量为9.0g/60kg·BW[15]，参照保健功能食品评价规范，设置人体推荐剂量的30倍作为干预剂量，且TWEs的提取率为33%±5%，得到小鼠的灌胃剂量为1.5g/kg·BW。PC组选用盐酸二甲双胍药物干预，根据成人的每日最大剂量(1～1.5g)，换算成小鼠用药剂量为250mg/kg·BW[16]。

1.3.4 葡萄糖耐量实验 在4w干预结束前，所有小鼠隔夜禁食不禁水15h，测定FBG，作为0时血糖。然后给小鼠灌胃葡萄糖1.5g/kg·BW，记录灌胃后30、60、90、120min血糖，并绘制时刻—血糖折线图[17]。按照式(1)计算折线图的曲线下面积。

AUC/(mmol·h/L)=(A/2+B+C+D+E/2)/2

(1)

式(1)中，A、B、C、D、E分别表示0、30、60、90、120min时刻的血糖值。

1.3.5 生化指标检测 干预结束后，所有鼠禁食12h，眼眶采血，将血样在4℃、3 500r/min离心15min，分离血清样本分别测定血清胰岛素水平(FIS)和FBG。

1.3.6 胰腺组织病理学分析 取小鼠胰腺组织于组织固定液，固定48 h，常规石蜡包埋，做切片，H&E染色，光学显微镜观察胰腺组织病理学变化，200倍视野下拍照。

1.3.7 实时荧光定量PCR检测 Trizol法提取小鼠肝脏总RNA[18]，检测RNA的浓度及OD260/OD280比值，将比值在1.8～2.0的样品用于反转录合成cDNA。取1μL的cDNA，上下游引物各0.3μL，ddH2O补充至10μL，按照梯度程序：95℃、10min，95℃、15 S，60℃、60 S循环35次。并以GAPDH为内参基因，采用2-(ΔΔCT)法[19]对糖代谢相关基因表达水平进行分析。所测基因为硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)、叉头转录因子(Foxo1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)(表1)。

表1 引物序列

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 TWEs主要功效成分含量

如表2所示，白茶TWEs的茶多酚含量明显高于TWE-HC大约为1.3～1.6倍。三种白茶TWEs中，芽型茶TWE-YZ的茶多酚含量显著高于多叶型茶TWE-SM和芽叶型茶TWE-MD(P<0.05)。可见，茶叶生产工艺和原料的嫩度影响茶叶的茶多酚含量。

表2 TWEs的主要功效成分 单位：mg/g

注：字母不同表示差异显著，P<0.05

由表2可知，茶多糖含量与茶叶嫩度相关，其中多叶型茶TWE-HC和TWE-SM茶多糖最高，芽叶型茶TWE-MD次之，芽型茶TWE-YZ最低，呈现梯度下降的规律。此外，对TWEs的黄酮类化合物总量进行测定发现，白茶TWEs的总黄酮含量相对较高，大约为TWE-HC的1.4倍。白茶TWEs中，TWE-SM和TWE-YZ黄酮含量较高，TWE-MD次之，未呈现与茶叶嫩度相关的梯度规律。

2.2 TWEs对糖尿病小鼠体重、摄食量及始末血糖的影响

由图1A可以看出，除NC和PC组外，所有组体重均有明显的降低，从第3周开始，TWEs组体重趋于稳定，而MC组体重波动较大，整体趋于降低。从图1B可以看出，只有NC组和PC组体重呈现正增长，而MC组及其他TWEs干预组均呈现出负增长，推测与注射STZ造成糖尿病模型有关，并且二甲双胍对维持小鼠正常体重具有较好作用。TWEs干预组中，YZ组与SM组体重增长百分比显著高于MC组(P<0.05)，说明TWE-YZ与TWE-SM有利于缓解糖尿病所造成的小鼠体重减轻症状，其他两种TWEs也有所缓解，但没有显著性。

由图1C可以看出，除NC组外，小鼠的摄食量都明显增加，出现了多食症状。并且MC组和PC组小鼠摄食量一直偏高，而TWEs组摄食量相对较小，低于MC组与PC组，说明TWEs干预可以一定程度上减轻小鼠的多食症状，而二甲双胍作用较弱。

由图1D可以看出，注射STZ后，测定了初始血糖值，糖尿病模型鼠组别之间没有显著差异(P>0.05)，并且FBG均在20mmol/L左右。MC组经过4w喂养后，FBG有一定升高，说明MC组小鼠的糖尿病病情不断恶化。TWEs干预组中，FBG均有一定程度降低，PC组、YZ组、MD组、SM组及HC组的血糖下降率分别为35.5%、21.7%、27.3%、34.8%及25.1%。可以看出，TWE-SM降血糖的效果最好，其作用效果与盐酸二甲双胍接近，其次为TWE-MD。

图1 TWEs对小鼠体重、摄食量及始末血糖值的影响注：*与正常组相比，P<0.05；**P<0.01；#与模型组相比，P<0.05；##P<0.01(下同)

图2 TWEs对小鼠葡萄糖耐量的影响

2.3 TWEs对糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影响

口服葡萄糖耐量实验可以确诊糖尿病[21]。图2A表明，MC组血糖在30min时明显升高，之后血糖虽有降低，但非常缓慢，表现出葡萄糖不耐受。TWEs组及PC组血糖在30min骤升之后，血糖恢复得相对较快，但难以区分各组间的差异性。由图2B可知，TWEs及二甲双胍均对小鼠葡萄糖耐受有一定程度的改善，其中PC组、HC组的AUC显著低于MC组(P<0.05)，而SM组则极显著低于MC组(P<0.01)，显示出了较好的效果。结合表2可知，TWE-SM和TWE-HC的茶多糖含量均较高，并且TWE-HC的茶多糖含量大约是TWE-SM的1.8倍，但是TWE-HC改善小鼠葡萄糖耐量的效果却不如TWE-SM。推测可能是由于TWE-SM的茶多酚、茶多糖及黄酮含量均相对较高，三者之间存在某种协同机制，改善小鼠的葡萄糖不耐受，进而降低小鼠血糖。Zhou等[22]分别以茶叶水提物(TWE)、粗茶多糖(CTP)及精制茶多糖(TPF)为原料，用四氧嘧啶诱导昆明小鼠建立糖尿病模型，研究上述三类物质的降血糖效果。结果表明，CTP降血糖效果最好，TPF次之。同样证明了茶叶中起降血糖作用的并非单一组分，而是多种组分互相协调的结果。

2.4 TWEs对HOMA模型的影响

根据小鼠FBG和FIS计算出了胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛β细胞功能指数(HOMA-B)，这种计算方式是基于肝脏葡萄糖的输出和胰腺胰岛素的分泌呈动态平衡，计算公式为[23]：HOMA-IR=FBG*FIS/22.5；HOMA-B=(20*FIS)/(FBG-3.5)%。由图3A和3B可以看出，TWEs及二甲双胍均对小鼠HOMA-IR有一定改善，其中MD组效果最好，HOMA-IR值显著低于MC组(P<0.05)。而HOMA-B值SM组最高，与NC组没有显著差异(P>0.05)。由此可见，不同TWEs均可调节FBG与FIS之间的平衡，但是其调节方式有所差异。

2.5 小鼠胰腺组织的病理学分析

如图4所示，NC组胰岛形态正常，胰岛细胞排列成团成索，染色浅；外分泌部为染色较深的浆液腺泡，腺细胞成锥形，细胞基部胞质呈强嗜碱性，顶部胞质含嗜酸性分泌颗粒，核大，圆形，近细胞基部。而MC组胰岛细胞变性，排列紊乱；基膜增厚，胰岛细胞核空泡化；胰岛捏毛细血管扩张。MC组胰岛细胞坏死，有脂肪变性征兆，胰岛损伤较为严重。而PC组胰岛细胞变性、坏死，核固缩、深染；毛细血管扩张；周围结缔组织增生，少量炎性细胞浸润，胰岛损伤同样较为严重，可见二甲双胍药物对胰腺组织病理学形态的改善并不显著。YZ组胰岛细胞出现肥大，脑浆空泡化。MD组胰岛细胞核深染。SM组胰岛肥大，淋巴细胞浸润；胰岛细胞变性，核固缩、深染。HC组胰岛细胞内出现了毛细血管扩张。可见，TWEs均在不同程度上改善了胰腺组织的病理学形态。

图3 TWEs对HOMA模型的影响

图4 小鼠胰腺组织病理学分析

图5 TWEs对糖代谢相关基因表达的影响

2.6 TWEs对糖代谢相关基因表达的影响

由图5A可知，MC组小鼠肝脏的TXNIP表达极显著升高(P<0.01)，TWEs的干预均使TXNIP的表达量极显著降低(P<0.01)，其中YZ和MD组的效果优于SM和HC组。TXNIP是胰岛细胞的炎症分子，可介导胰岛β细胞的凋亡。可见，四种TWEs均可下调TXNIP的表达量，减缓胰岛细胞炎症，抑制TXNIP所介导的β细胞凋亡[24]。由图5B可知，MC组小鼠肝脏的Foxo1表达显著升高(P<0.05)，TWEs的干预均使Foxo1的表达量极显著降低(P<0.01)，且各组间没有显著差异。Foxo1是胰岛β细胞的关键调控因子，可β细胞的增殖，促进糖异生相关基因的表达，使得胰岛素的分泌量减少，葡萄糖的生成量增加，血糖升高[25-26]。由图5C可知，SM组的GLUT4表达量显著高于NC组(P<0.05)，而GLUT4可激活葡萄糖蛋白转运受体，促进葡萄糖的吸收与利用[27]。由此可见，TWE-SM可通过上调GLUT4的表达量来提高糖尿病鼠的葡萄糖利用效率，进而达到降低糖尿病小鼠血糖的作用。由图5D可知，MC组和HC组PEPCK1的表达量显著高于NC组(P<0.01)，3种白茶TWEs干预均使其表达量显著下调(P<0.01)，且三者无显著差异。PEPCK1是糖异生的关键调控基因，促进葡萄糖的合成。因此，3种白茶TWEs通过下调糖异生的关键调控基因，进而抑制葡萄糖合成路径。

3 结论

在实验所设剂量下，白毫银针、白牡丹、寿眉及黄大茶水提物均可降低小鼠血糖，其中寿眉水提物最为明显，白牡丹水提物次之；四种茶叶水提物均可改善小鼠葡萄糖耐量，其中寿眉水提物具有极显著作用，黄大茶水提物有显著作用；白牡丹水提物可显著改善小鼠胰岛素抵抗。综上所述，多叶型茶寿眉改善糖尿病小鼠病症效果较好。白毫银针和白牡丹水提物可通过下调TXNIP、Foxo1及PEPCK1的表达量，来减缓胰岛细胞炎症，抑制胰岛β细胞的凋亡，并抑制糖异生通路；寿眉水提物通过上调GLUT4的表达量，下调PEPCK1的表达量，促进葡萄糖的吸收与利用，并抑制糖异生通路，直接调节了血糖水平。黄大茶水提物也可调控部分基因的表达量，但效果不如白茶显著。因此，三种白茶均有降血糖功效，而且多叶型茶寿眉的降血糖效果更为明显，优于同为多叶型茶的黄大茶，推测是由于寿眉茶多酚与茶多糖含量均较高的缘故，而茶多酚与茶多糖协同降血糖的机理，还有待进一步研究。◇

[1]American Diabetes Association.Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J].Diabetes Care，2014，37(Suppl 1)：S81-90.

[2]缪海韬，顾卫琼.青少年1型和2型糖尿病远期转归的比较[J].中国糖尿病杂志，2014，6(12)：910-912.

[3]黄世杰.二甲双胍在2型糖尿病初始药物治疗中的作用：亚洲—太平洋地区展望[J].国际药学研究杂志，2007，34(5)：387-389.

[4]吕海鹏，张悦，陈兴华，等.不同花色种类白茶的抗氧化活性及其主要品质化学成分分析[J].食品科学，2016，37(20)：42-50.

[5]Xu Y，et al.The anti-obesity effect of green tea polysaccharides，polyphenols and caffeine in rats fed with a high-fat diet[J].Food & Function，2015，6(1)：297.

[6]李海珊，刘丽乔，聂少平.茶多糖对小鼠肠道健康及免疫调节功能的影响[J].食品科学，2017，38(7)：187-192.

[7]陆鹏，王校常，汪瑛琦.茶叶在抵抗Ⅱ型糖尿病中的作用[J].浙江大学学报(农业与生命科学版)，2016，42(3)：358-367.

[8]Han M，et al.Safety and anti-hyperglycemic efficacy of various tea types in mice[J].Scientific Reports，2016，6：31703.

[9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 30766—2014茶叶分类[M].北京：中国标准出版社，2014-10-27.

[10]中华人民共和国卫生部门.保健食品检验与评价技术规范(2003年版)[S].北京：卫生部卫生法制与监督司编印，2003：11-12.

[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 8313—2008.中华人民共和国国家标准—茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法[M].北京：中国标准出版社，2008-05-04.

[12]傅博强，谢明勇，聂少平，等.茶叶中多糖含量的测定[J].食品科学，2001，22(11)：69-73.

[13]马陶陶，张群林，李俊，等.三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨[J].时珍国医国药，2008，19(1)：54-56.

[14]Islam M S，Loots T D.Experimental rodent models of type 2 diabetes：a review[J].Methods & Findings in Experimental & Clinical Pharmacology，2009，31(4)：249.

[15]王蝶.茶叶对肥胖大鼠的减肥作用及机制研究[D].湖南农业大学，2012.

[16]黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9(9)：1069-1072.

[17]玄光善，潘士佳，南姬.桑叶有效成分降糖作用研究[J].食品科学，2011(7)：323-326.

[18]Simms D，Chomczynski P.TRIzolTM：a new reagent for optimal single-step isolation of RNA[J].Focus，1993.

[19]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods，2012，25(4)：402-408.

[20]Wolfram S，Raederstorff D，Preller M，et al.Epigallocatechin gallate supplementation alleviates diabetes in rodents[J].Journal of Nutrition，2006，136(10)：2512.

[21]李竞，叶迎春，李芳林，等.口服葡萄糖耐量试验在糖尿病诊断中的价值[J].中国实用内科杂志，2003，23(8)：494-495.

[22]Zhou X，et al.Effects of soluble tea polysaccharides on hyperglycemia in alloxan-diabetic mice[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2007，55(14)：5523-5528.

[23]Tang W，Li S，Liu Y，et al.Anti-diabetic activity of chemically profiled green tea and black tea extracts in a type 2 diabetes mice model via different mechanisms[J].Journal of Functional Foods，2013，5(4)：1784-1793.

[24]Shalev A.Lack of TXNIP protects β-cells against glucotoxicity[J].Biochemical Society Transactions，2008，36(Pt 5)：963-965.

[25]黄荷.Foxo1对糖尿病胰腺β细胞的作用[J].内科，2009，4(3)：404-407.

[26]Hou X，Song J，Li X N，et al.Metformin reduces intracellular reactive oxygen species levels by upregulating expression of the antioxidant thioredoxin via the AMPK-FOXO3 pathway[J].Biochemical & Biophysical Research Communications，2010，396(2)：199.

[27]Li S，Chen H，Wang J，et al.Involvement of the PI3K/Akt signal pathway in the hypoglycemic effects of tea polysaccharides on diabetic mice[J].International Journal of Biological Macromolecules，2015，81：967.