李 腾， 黄桂兰*, 袁 铃, 周世坤*

(防化研究院，北京 102205)

核磁共振(NMR)是一种无损分析检测技术，1H-NMR可以提供丰富的化合物结构信息，但在实际应用中，若采用1H-NMR技术检测，样品基质背景干扰太大，掩盖目标化合物信号峰，对化合物的鉴定存在干扰；而31P{1H}-NMR技术可以在复杂基质干扰下，只对含磷化合物产生信号响应[1]，并且其化学位移谱宽一般为-30～200 ppm，比氢谱化学位移宽的多，同时在对氢去偶的条件下，其谱峰信号为单峰，方便对化合物的指认[2 - 3]。奎宁醇、硫二甘醇、甲基二乙醇胺、三乙醇胺、二异丙胺基乙醇是一类在制药工业和化学毒剂合成中具有广泛用途的化合物，是禁止化学武器公约组织(OPCW)实施核查检测的目标化合物[4]。

Martin等[5]报道了利用氨基磷酸单酯作为磷酰化试剂通过SN2机理反应衍生醇形成磷酸二酯。陈茹玉等[6]报道了磷脂的不对称合成，其中运用了POCl3在水中作为磷酰化试剂磷酰化醇。Avik等[7]利用2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环(CTMP)磷酰化衍生非含磷化武相关化合物，并通过31P{1H}-NMR确认。丁贻祥等[8]等报道了利用二乙基磷酰氯作为磷酰化试剂与苯基丙酮反应生成两个O-磷酰化产物。本文以二苯基次膦酰氯[9]、POCl3[10]、CTMP[11]为磷酰化试剂，以31P{1H}-NMR为检测手段，研究了奎宁醇、硫二甘醇、甲基二乙醇胺、三乙醇胺和二异丙胺基乙醇转化为含磷化合物的衍生条件。进而通过31P{1H}-NMR间接鉴定这些醇类化合物。考察了衍生产物的稳定性、方法检出限及回收率。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Varian NMR System 600超导核磁共振仪(美国，Varian公司)，600 MHz 5 mm脉冲梯度场双通道宽带多核共振探头，工作站软件VnmrJ 2.1B和VnmrJ 4.0；移液枪(德国，Eppendorf公司)。

二苯基次膦酰氯(分析纯，美国Sigma-Aldrich公司)；POCl3(分析纯，美国Sigma-Aldrich公司)；2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷杂戊环(CTMP)(分析纯,美国Sigma-Aldrich公司)；氘代氯仿(CDCl3，99.8%氘代度，含0.03%TMS，CIL公司)；其他试剂均为分析纯。奎宁醇、硫二甘醇、甲基二乙醇胺、三乙醇胺、二异丙胺基乙醇由本院提供。

1.2 磷谱检测条件

图1 磷酰化衍生反应式Fig.1 The phosphorylation reactions for alcohol compounds

31P{1H}-NMR检测条件：31P核共振频率：242.812 MHz；谱宽sw=59523.8 Hz；射频功率：tpwr=54 dB；90度脉冲宽度：pw90=9.75 μs；检测脉冲宽度：pw=3.25 μs；脉冲延迟时间：d1=0.3 ms；采样时间：at=1 ms；氢去偶射频功率：dpwr=42 dB；去偶方式：dm=’yyy’；接收机增益：gain=autogain；检测温度：25 ℃。

1.3 磷酰化衍生反应

磷酰化衍生反应见图1。醇类化合物溶解于衍生溶剂，取0.5 mL转移入核磁管中，先后加入10 μL等体积的吡啶和磷酰化试剂，摇匀，室温或水浴加热反应，进行31P{1H}-NMR检测。

2 结果与讨论

2.1 磷酰化试剂的选择

实验以二异丙胺基乙醇作为醇类化合物的代表，以CDCl3为衍生溶剂，考察三种磷酰化试剂衍生效果。取0.5 mL×1 μmol/mL 二异丙胺基乙醇/CDCl3溶液于核磁管中，加5 μL磷酰化试剂反应1 h；同时取0.5 mL CDCl3、5 μL磷酰化试剂混合作为空白对照样品进行31P{1H}-NMR检测。结果发现，磷酰化试剂CTMP与二苯基次膦酰氯的衍生效果最好，可以明确分辨出衍生产物峰，而三氯氧磷过于活泼，在反应5 min监测就有四个产物峰，无法具体指认三氯氧磷与二异丙胺基乙醇的反应产物。综上考虑，磷酰化试剂选用CTMP与二苯基次膦酰氯。

2.2 磷酰化衍生产物磷谱化学位移的确定

将醇类化合物溶解于CDCl3后，取0.5 mL于核磁管中，加入5 μL磷酰化试剂，摇匀，室温下放置1 h，同时取0.5 mL CDCl3、5 μL磷酰化试剂混合作为空白对照样品进行31P{1H}-NMR检测。结果如表1所示。

表1 醇类化合物磷酰化衍生产物31P{1H}-NMR化学位移

2.3 衍生条件的选择优化

2.3.1衍生溶剂的选择磷酰化试剂对水比较敏感，因此衍生反应需在非质子化溶剂中进行。实验考察了以CH2Cl2、CDCl3和DMF作为衍生溶剂。取0.5 mL×1 μmol/mL 奎宁醇/衍生溶剂溶液于核磁管中，加5 μL磷酰化试剂室温反应1 h；0.5 mL 衍生溶剂、5 μL磷酰化试剂混合作为空白对照样品进行检测，以产物峰信噪比作为监测指标。结果奎宁醇在CH2Cl2、CDCl3与DMF与CTMP反应并无大的区别，信噪比依次为33、39、34；而奎宁醇在CH2Cl2与CDCl3中与二苯基次膦酰氯的反应没有衍生产物生成。以DMF为溶剂时，奎宁醇与二苯基次膦酰氯的反应产物信噪比为8，有少量目标产物生成，可能原因为奎宁醇与二苯基次膦酰氯反应因存在空间位阻，反应较困难，当使用DMF做溶剂，可以起到缚酸剂的作用，促使反应正向进行，因此衍生溶剂选择DMF。

2.3.2吡啶对衍生反应的影响以0.5 mL×10 μmol/mL 甲基二乙醇胺/DMF溶液与10 μL二苯基次膦酰氯为研究对象，考察缚酸剂吡啶对衍生反应的影响。实验结果表明，加缚酸剂可以明显提高反应速率，因此该衍生反应选择加10 μL吡啶作为缚酸剂。

图2 不同时间CTMP对醇类化合物的衍生效率Fig.2 The derivatization efficiency at different time using the derivatization reagent CTMP

图3 不同时间二苯基次膦酰氯对醇类化合物衍生效率Fig.3 The derivatization efficiency at different time using the derivatization reagent diphenyl phosphinyl chloride

2.3.3时间对衍生结果的影响选择以多元醇全部羟基与磷酰化试剂衍生的产物作为监测对象。取0.5 mL×10 μmol/mL醇类化合物/DMF溶液于核磁管中，加过量磷酰化试剂反应，考察时间对衍生结果的影响，如图2、图3所示。使用CTMP作为衍生试剂时，其反应活性特别高，但衍生产物随着时间的增长在减少，说明由CTMP作为衍生试剂衍生醇类化合物产物稳定性不是很好；并且发现衍生产物最终降解的产物大约在16.54 ppm，而CTMP与水反应的产物也是16.54 ppm，说明水解是导致衍生产物不稳定的原因。由二苯基次膦酰氯作为磷酰化试剂衍生醇类化合物，其反应活性虽没有CTMP反应活性高，但随着时间的推移，衍生产物量逐渐增多，且最后衍生产物稳定；而利用二苯基次膦酰氯衍生奎宁醇在常温下反应量极少，无法积分检测，因此在50 ℃水浴条件下加热1 h，结果发现其衍生产物明显增多，采用归一化积分方法，其衍生效率约为89%。

2.3.4温度对衍生结果的影响考虑到常温下CTMP对醇类化合物的衍生结果不稳定，因此不考察温度对CTMP衍生醇类化合物结果的影响。以0.5 mL×1 μmol/mL甲基二乙醇胺为研究对象，二苯基次膦酰氯为磷酰化试剂，考察了不同温度(25 ℃、50 ℃和75 ℃)对衍生结果的影响。加热可以促进反应速率，但使用50 ℃与75 ℃作为反应温度差别并不是很大，因此选择反应温度为50 ℃，反应时间为1 h。

2.4 衍生产物的稳定性

实验考察了CTMP衍生0.5 mL×1 μmol/mL醇类化合物的稳定性，结果显示反应5 min，5种化合物的CTMP衍生产物信噪比基本大于3，但随着时间的推移，信噪比依次降低，到30 min后就检测不到了,即CTMP衍生醇类化合物的产物不稳定。利用二苯基次膦酰氯对1 μmol/mL的醇类化合物衍生，衍生温度采用50 ℃，衍生时间1 h，10 μL吡啶作为缚酸剂，考察了其日间稳定性，结果表明，由二苯基次磷酰氯衍生醇类化合物产物具有良好的稳定性。

2.5 衍生方法的检出限

在31P{1H}-NMR检测条件下，以二苯基次膦酰氯为衍生试剂，DMF为衍生溶剂，奎宁醇、硫二甘醇、甲基二乙醇胺、三乙醇胺、二异丙胺基乙醇的检出限，考察结果依次为9、7、6、6、10 μg/mL。

2.6 水样基质中方法的应用

以二异丙胺基乙醇为醇类代表，取0.5 mL×50 μmol/mL和5 μmol/mL水溶液，用1 mol/L的HCl调pH值为1，旋蒸至干，用0.5 mL DMF复溶，加20 μL吡啶以除去酸，加40 μL二苯基次磷酰氯以保证衍生化试剂过量，50 ℃水浴加热反应1 h，31P{1H}-NMR检测。归一化法得到两种浓度下回收率依次为69%和53%。

3 结论

采用二苯基次膦酰氯为衍生试剂，DMF为溶剂，在核磁管内原位衍生醇类化合物测定磷谱的分析方法，为解决复杂背景下非磷化学毒剂前体的1H谱无法满足鉴定要求的问题，提供了一种简便的解决途径。所建立方法具有反应专一、产物稳定、方法简便的特点。

参考文献：

[1] Messilakso M.Chemical Weapons Convention Chemicals Analysis,Sample Collection,Preparation and Analytical Methods.Chichester:John Wiley & Sons Ltd：2005，322.

[2] YE R H.Study and Application of NMR Spectra of Phosphorus-containing Compounds.Guangzhou:Guangdong University of Technology(叶汝汉.含磷化合物的核磁共振谱图研究与应用.广州:广东工业大学),2011.

[3] MA R.Characteriaztion of Phosphorus Forms in Environmental Materials and their Transformation in Soils by31Phosphorus Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy.Nanjing:Nanjing Agricultural University(马瑞.利用31P-NMR技术研究环境样品中磷形态特征及其在土壤中形态转换.南京:南京农业大学),2009.

[4] Convention on the Prohibition of the Development,Production,Stockpiling and Use of Chemical Weapons and their Destruction(1997) Technical Secretariat of the Organization for Prohibition of Chemical Weapons.The Hague,The Netherlands.http://www.opcw.org.

[5] Martin J P.Chem Commun,2004,1952.

[6] CHEN R Y,ZHOU J.Organic Chemistry (陈茹玉，周嘉.有机化学),1997,(17):193.

[7] Avik M,Ajeet K,Ajay K,et al.Anal Bioanal Chem,2012,402:1643.

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[9] Naoyoshi M,Akemi F,Yuki H,et al.Tetrahedron,2002,58:3493.

[10] YUAN C Y,LONG H Y,SHEN D Z,et al.Scientia Sinica(袁承业，龙海燕，沈定璋，等.中国科学),1984,12：1088.

[11] HUANG G L,YUAN L,LIU S L,et al.Chin J Anal Chem(黄桂兰，袁铃，刘石磊，等.分析化学)2015,43(12)：1927.