江成英 ， 王 松 ， 张文学 ， 韩国栋 ， 郭宏文 ， 韩 颖 ， 祝露露

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

玉米蛋白粉也称为玉米麸质粉，是加工玉米淀粉的副产物之一，主要成分为玉米醇溶蛋白和玉米黄色素（赵文扬等，2015），其中醇溶蛋白的含量可高达45%，而水溶性蛋白仅占3%左右，因而玉米蛋白粉水溶性特别差，且所含蛋白质缺少赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸，所以其生物学价值低（Shukla，2001），将其用于饲料工业，存在蛋白质消化利用率低的问题。采用微生物发酵的方法可提高玉米蛋白的可溶性，从而提高其作为饲料的动物消化利用率，促进玉米蛋白质资源的有效利用（王燕等，2014）。

生产微生物发酵饲料的首要问题是选择合适的菌种。目前微生物发酵饲料最常使用的菌种为酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、链球菌属及部分霉菌等（刘艳新，2017）。本研究以发酵饲料中可溶性蛋白为指标，筛选出酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌的三菌组合用来生产玉米蛋白粉发酵饲料。

1 材料与方法

1.1 主要材料及设备 菌种：热带假丝酵母、啤酒酵母、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳酸杆菌、嗜热乳酸杆菌均由齐齐哈尔大学生物工程实验室提供。

原料：玉米蛋白粉、麸皮均为市售。

试剂：葡萄糖、胰蛋白胨、酵母浸出物、氯化钠、牛肉膏、琼脂、磷酸氢二钾、柠檬酸二铵、醋酸钠、吐温 80、七水合硫酸镁、四水合硫酸锰、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、三氯乙酸等均为国产分析纯。

设备：电热恒温培养箱 （上海跃进医疗器械厂），PHS-25数显pH计 （上海精密科学仪器有限公司），超净工作台（上海智城分析仪器有限公司），BS224S型电子天平（北京塞多利斯仪器厂），手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），紫外可见分光光度计（日本岛津仪器厂）等。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制 筛选培养基：5 g玉米蛋白粉、pH中性，2 g琼脂，定容至100 mL，121℃蒸汽灭菌；发酵培养基：35 g玉米蛋白粉、15 g麸皮、50 g水，pH中性，121℃蒸汽灭菌；PDA培养基：取约200 g的马铃薯，去外皮后切成较碎小块，煮沸约40 min后进行过滤，将滤液配成1000 mL的溶液，葡萄糖20 g，pH自然，固体培养基加入2%琼脂；NA培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉3.0 g、氯化钠5.0 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.3，固体培养基加入2%琼脂；MRS乳酸细菌培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏 5.0 g、柠檬酸氢二铵 2.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐温 80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾 2.0 g、硫酸镁 0.58 g、硫酸锰0.25 g、琼脂 18.0 g、蒸馏水 1000 mL，pH 6.5，固体培养基加入2%琼脂。

1.2.2 菌种活化 在高压蒸汽灭菌锅内对已配制的培养基进行灭菌，分别将热带假丝酵母、啤酒酵母接种到PDA培养基，凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌接种到NA培养基，嗜酸乳酸杆菌、嗜热乳酸杆菌接种到MRS乳酸细菌培养基上，放入培养箱内30℃下培养48 h备用。

1.2.3 平板培养 首先确定菌种是否对玉米黄粉具有利用能力。将活化好的八株菌在筛选培养基上划线培养，每菌三个平行，在30℃恒温条件下培养48 h，观察各菌种的生长情况。

1.2.4 发酵试验 将能利用玉米蛋白粉的菌种活化后接种于固体发酵培养基上，置于30℃条件下发酵一定时间，测定其可溶性蛋白含量。

1.2.5 正交试验 以筛选出的三种菌株另加一空列为因素，接种量为水平，设计四因素三水平（L934）的正交试验。三种菌株分别活化后，按一定比例接种于发酵培养基中，30℃发酵144 h，根据所测定的发酵玉米蛋白粉饲料中可溶性蛋白含量，对配合菌株的接种比例进行确定。

1.2.6 主要测定方法 可溶性蛋白含量的测定采用福林酚法（王永华，2010）。

2 结果与讨论

2.1 菌种利用玉米蛋白粉能力测定 将待选的八种菌株分别在含有5%玉米蛋白粉的筛选固体培养基上划线培养，根据其生长状况确定其对玉米蛋白粉的利用能力。结果表明，本研究所采用发酵饲料常用的八种菌种在筛选培养基上均长势良好，说明都具有较强的利用玉米蛋白粉的能力，故这八种待选菌株均可作为发酵玉米蛋白粉发酵菌种。

2.2 发酵用配合菌株的选择 由于所选用的八种菌株均能利用玉米蛋白粉，故都用于发酵用配合菌株的筛选。将其分别活化后，以5%的接种量接入发酵培养基中，置于30℃恒温培养箱中发酵培养。每24 h取样测定其中的可溶性蛋白含量，以确定各种菌株发酵玉米蛋白粉的能力。结果见表1。

表1 各菌种发酵玉米蛋白粉的可溶性蛋含量%

据表1可以看出，所选用的八种菌株接入发酵培养基后，随着时间的延长，发酵饲料中的可溶性蛋白含量均逐步提高。其中芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌发酵的效果最好，在144 h时可溶性蛋白含量为10.44%；酵母菌中热带假丝酵母菌发酵的结果较好，在144 h时可溶性蛋白含量为9.48%；乳酸杆菌中嗜热乳酸杆菌发酵的结果最好，在144 h时可溶性蛋白含量为9.04%。

目前微生物发酵饲料最常使用的菌种为酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、链球菌属及部分霉菌等，饲料酵母可产多种动物所需的消化酶，对营养物质的消化吸收起着重要作用，同时酵母菌具有浓烈的酵母香味，对家畜增加食欲、增强消化吸收等有一定作用（Puniya，2015）；芽孢杆菌具有较强的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，可明显提高饲料利用率，还可以消耗大量的氧气，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡，增强机体免疫力（李春凤，2013）；乳酸菌可以提高饲料的品质，并能直接促进动物生长，改善消化道微生态环境，调节消化道免疫系统，具有替代含抗生素饲料的潜能（王芳芳，2016）。每种菌在发酵饲料中都有不同的功效，因此混合发酵效果要优于单菌发酵。

综上所述，选择枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和嗜热乳酸杆菌做为发酵玉米蛋白粉饲料的配合菌株。

2.3 配合菌株比例的确定 将所选出的三种配合菌株进行正交试验，以确定菌种的最佳比例。结果见表2。

表2 正交试验设计与试验结果

由表 2 分析可知，RB＞RC＞RA，即因素的主次顺序依次为枯草芽孢杆菌（因素B），热带假丝酵母菌（因素C），嗜热乳酸杆菌（因素A）；各因素水平的比较：KB3＞KB2＞KB1，KC2＞KC1＞KC3，KA3＞KA1＞KA2，由此得出利用枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和嗜热乳酸杆菌发酵玉米蛋白粉饲料的最佳接种比例组合为A3B3C2，即嗜热乳酸杆菌：枯草芽孢杆菌：热带假丝酵母菌=3∶3∶2，通过验证试验，在此接种比例下，发酵玉米蛋白粉中可溶性蛋白含量达到最高为14.47%，较发酵之前的3.04%提高了11.43%。

3 结论

通过平板培养和发酵试验相结合的方法，筛选出以玉米蛋白粉为主要原料生产发酵饲料的菌种为嗜热乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母；利用正交试验确定所用三种菌株的比例为嗜热乳酸杆菌：枯草芽孢杆菌：热带假丝酵母=3∶3∶2。

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