史春麟，李晓焕，黄翔翔*



绿茶多酚对被动吸烟引起小鼠肺氧化应激的干预研究

史春麟1，李晓焕2，黄翔翔2*

1. 湖南师范大学附属中学，湖南 长沙 410006； 2. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128

研究了绿茶多酚（Green tea polyphenol，GTP）对被动吸烟致小鼠肺部氧化应激损伤的干预作用，并探讨其可能机制。将40只KM雌性小鼠随机分成正常对照C组、被动吸烟模型M组、100 mg·kg-1GTP1组、200 mg·kg-1GTP2组，每组10只。实验12周结束后处死小鼠，测定其肺质量及血清氧化应激炎症水平；采用荧光定量PCR测定白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素33（IL-33）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）基因表达水平。研究结果表明，与M组相比，灌喂GTP后使得小鼠生存质量、肺形态有明显改观，显著提高小鼠血清T-SOD及GSH-Px活力，显著降低MDA、IL-6、TNF-α表达水平，显著抑制IL-6、IL-33、TNF-α及IL-1β炎性相关基因的表达，灌胃200 mg·kg-1GTP比100 mg·kg-1的GTP作用更加显著。研究发现，GTP可能通过抑制炎性细胞因子表达水平、提高抗氧化能力来保护肺部组织形态与结构的完整，保护被动吸烟对肺部的损害。

绿茶多酚；被动吸烟；肺组织；氧化应激

我国是世界上烟草生产、消费量最大的国家，吸烟率在37%以上。因对吸烟环境管控不严格，导致诸多被动吸烟环境。研究显示，香烟侧流烟雾中苯并芘含量比主流烟雾高出5倍，二甲基甲硝胺则高出几十倍[1]。流行病学调查吸烟家庭儿童呼吸道疾病远多于不吸烟家庭，丈夫吸烟其妻子发生肺癌是不吸烟者的2倍，并使孕妇胎儿产前死亡率增加65%[2]。对小鼠进行香烟烟雾（Cigarette smoke，CS）暴露可诱发肺形态学变化及氧化应激，总超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活性增加[3]，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）浓度增高，但绿茶在一定程度上能抑制CS诱导的肺氧化应激损伤[4]。茶多酚（Tea polyphenols，TP）是绿茶的主体抗氧化成分，以儿茶素占主导地位，儿茶素主体成份表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）可以显著降低香烟烟雾冷凝物（Cigarette smoke condensate，CSC）诱导人支气管上皮细胞DNA损伤及细胞凋亡[5-6]，抑制人类正常支气管上皮细胞核因子活化B细胞κ轻链增强子（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）的活化[7]，显著上调鼠肺泡巨噬细胞系（MH-S）响应感染CSC、抑制白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α）的产生[8]。由此可知，TP抵抗CS氧化应激主要集中在CSC方面，而模拟人被动吸烟环境，系统研究绿茶多酚（Green tea polyphenols，GTP）干预小鼠被动吸烟其肺部炎性细胞因子表达水平、氧化应激能力等还未见研究报道。因此，本实验拟通过小鼠体质量、肺质量及血清氧化应激炎症水平的变化；以及肺组织IL-6、白细胞介素33（Interleukin-33，IL-33）、TNF-α、白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）等炎性基因表达研究，分析探讨GTP对被动吸烟小鼠肺损伤氧化应激的保护机制，旨在为GTP在被动吸烟环境的抗氧化应用及防护提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

绿茶多酚（GTP），含量大于等于98%，其中EGCG纯度大于50%，由湖南农业大学茶学教育部重点实验室自行制备；43F116标准香烟，由湖南中烟公司提供。T-SOD、丙二醛（Malondialdhyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）测试盒购自南京建成生物工程研究所；小鼠IL-6、TNF-α酶联免疫分析（ELISA）试剂盒购自Bio-Swamp公司。实时荧光定量PCR试剂盒SYBR premix EX TaqTM（TLi RNaseH Plus）（Takara公司，日本）；逆转录试剂盒PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara公司，日本）；IL-6、IL-33、TNF-α、IL-1β等PCR（qRT-PCR）引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；Trizol、DEPC等常规试剂为国产。

1.2 仪器设备

自制透明有机玻璃小鼠被动吸烟箱（长×宽×高：1.0 m×0.6 m×0.6 m），顶部和周围开有数个直径5 cm的通气口，香烟固定在底部通气孔上，烟雾浓度用注射器容量进行调配。全波长酶标仪（Thermo scientific，德国）、冷冻离心机（MIKRO 22R型台式、德国Hettich公司）、梯度PCR仪（Applied Biosystems，美国）、NanoDrop 2000/2000c分光光度仪（Thermo Scientific，德国）、实时荧光定量PCR仪（Roter-Gene Q，美国）等。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

昆明种（KM）SPF级雌鼠40只，4周龄，由斯莱克景达实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（湘）2011-0003。小鼠饲养于湖南农业大学茶叶研究所，饲养环境温度（25±1）℃，湿度40%~70%，光照时间12 h昼夜交替，自由饮用水和基础饲料，基础饲料主要营养成分：粗蛋白24.3%，粗灰粉8.6%，粗脂肪7.5%，粗纤维3.5%，钙1.16%，磷0.7%，含水量7.5%。因小鼠年龄较小，适应性喂养一周，期间自由饮水、进食。适应性饲养1周后，以体重为权重，将40只小鼠随机分为正常对照组（The control group，C Group）10只，生存在正常环境下；被动吸烟组30只，第1个月每两天增加一支香烟，增加至每天12支烟为止；第2个月开始每天被动吸烟12支（每天6次，每次2支，每支10 min）。上述小鼠被动吸烟2个月后，从被动吸烟组小鼠中随机抽取20只，随机分为两组，每天上午被动吸烟前灌喂GTP，分别为100 mg·kg-1、200 mg·kg-1GTP；另10只小鼠进行被动吸烟处理，正常饮水摄食，被动吸烟处理共持续3个月，以此方法来建立小鼠被动吸烟模型（Passive smoking group，Model Group）。建立C正常对照组、M被动吸烟模型组、100 mg·kg-1GTP（GTP1）干预组、200 mg·kg-1GTP（GTP2）干预组。

1.3.2 小鼠生存状况观察

每日观察各组小鼠精神状态、活泼状态、毛发色泽等情况，每日定量为每组小鼠添加(50±2) g饲料，回收并称量当日剩余饲料，记录小鼠进食量变化，并且每周记录小鼠体重变化。

1.3.3 样本采集

实验处理12周结束后，处死前禁食12 h，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，收集眼球血、离心获得血清；打开胸腔取出全肺，右肺用于肺组织病理学观察，左肺使用预冷的0.9%的NaCl溶液清洗，放于冻存管中存于–80℃冰箱以备基因分析。

1.3.4 肺组织病理学观察

肺组织经PBS清洗后拍照，剪取右肺上叶用10%的甲醛浸泡24 h，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.3.5 血清中T-SOD、MDA、GSH-Px、IL-6、TNF-α检测

小鼠眼球取血收集于1.5 mL或2 mL离心管中，静置于4℃冰箱1 h后，4℃下3 000 r·min-1离心15 min，共离心2次，小心收集上清，按照检测试剂盒说明书操作，检测T-SOD、MDA、GSH-Px、IL-6、TNF-α表达变化。

1.3.6 肺组织IL-6、IL-33、TNF-α、IL-1β基因RT-PCR检测

1.4 统计学方法

2 结果与分析

2.1 对小鼠一般体征变化的影响

小鼠在适应饲喂期间生存状态良好，平均体重增加了5 g；被动吸烟造模期间，表现出与正常对照组明显不同的生存状态，被动吸烟初期对烟雾反应剧烈，每次被动吸烟结束后异常活跃，精神亢奋，啃咬鼠笼铁丝；被动吸烟造模后期对外界刺激反应迟钝，精神倦怠，活动减少，食欲下降，体重减轻，毛发由最初的雪白色变得焦黄、粗糙、无光泽。

表1 IL-6、IL-33、TNF-α、IL-1β、β-actin引物序列

图1 被动吸烟对小鼠体重的影响

被动吸烟及GTP灌喂干预对各实验组小鼠体重产生明显影响（图1）。被动吸烟造模4~8周，正常对照C组体重增加明显高于被动吸烟组，呈显著差异（<0.05）；9~12周继续被动吸烟造模及灌喂GTP水液的3个实验小组，模型M组体重呈持续下降趋势，GTP灌喂干预的2个小组体重维持平稳，并呈轻度增加趋势，这可能是GTP对被动吸烟诱发的炎症有一定的消减、干预作用，使得小鼠生存质量趋于好转、体重有所回升。

2.2 对小鼠肺组织病理学变化的影响

解剖小鼠后发现其肺部外观形态差异较大。被动吸烟模型M组小鼠两肺呈暗红色，表面有斑点状陈旧性出血灶，体积增大，质地变硬，弹性较差，局部胸膜黏连；GTP1灌喂干预组的小鼠两肺颜色变浅，有少许胸膜黏连，表面有少许斑点状出血灶，体积较M组小，硬度较正常对照C组硬但明显较M组软；GTP2灌喂干预组肺部形态与正常对照相比，部分肺泡壁崩解破坏，总体变化恶化程度较M组有所减轻。

由图2可知：在M组（图2-B），发现其肺泡隔变厚，肺泡隔损害，腔体扩张变大，有明显渗血、炎症现象；GTP1灌喂干预组（图2-C）肺组织出血及肺间质水肿明显减弱，肺泡腔与C组（图2-A）相比较呈不规则、有些破裂导致肺泡腔变大，肺泡隔增厚，仍有明显出血等炎症发生；GTP2（图2-D）灌喂干预组肺泡组织形态已基本恢复正常。

注：A：正常组，B：模型组，C：100 mg·kg-1 组，D：200 mg·kg-1 组。

注：A：正常组，B：模型组，C：100 mg·kg-1 组，D：200 mg·kg-1 组。

由图3可知：M组（图3-B）气管纤毛上皮细胞消失，间质血管扩张充血，有大量炎性细胞浸润；GTP1灌喂干预组小鼠肺气管黏膜基本恢复正常，但与C组（图3-A）比较其气管周围仍有炎性细胞浸润；GTP2灌喂干预组与正常对照组比较，肺气管基本恢复正常，但修复后的肺气管明显增大。

由图2、图3小鼠肺部肺泡、肺气管病理学切片可知，被动吸烟导致小鼠肺发生了明显病理性炎症，但GTP具有明显修复作用，尤以200 mg·kg-1的GTP2灌喂干预效果为佳。

2.3 对小鼠血清氧化应激因子表达水平的影响

小鼠血清中T-SOD、MDA、GSH-Px水平高低反映了体内氧化应激水平。由表2可知，与C组相比，M组T-SOD、GSH-Px水平显著降低（＜0.05），MDA含量显著升高（＜0.05）；灌喂GTP进行干预，与M相比，GTP1组、GTP2组均显著减少MDA含量（＜0.05）；显著增加T-SOD、GSH-Px水平（＜0.05），GTP2组比GTP1组作用更加显著；GTP2干预组T-SOD、MDA水平已基本恢复至C组水平，GSH-Px水平高于C组。由此可知，被动吸烟使得小鼠血液产生较高氧化应激水平，灌喂茶多酚可能起到干预作用，200 mg·kg-1GTP灌喂量效果更加明显。

2.4 对小鼠血清细胞因子表达水平的影响

IL-6、TNF-α与肺部炎症发生及发展密切相关。由表3可知，与C相比，M型组IL-6、TNF-α含量显著升高（＜0.05）。经GTP干预后，与M比较，GTP1组和GTP2组均显著减少IL-6、TNF-α含量（＜0.05），GTP2组比GTP1组作用更加显著；与C组比较，GTP2组已基本恢复到C组水平。说明被动吸烟组小鼠肺部存在较高的炎症反应，100 mg·kg-1的GTP1干预能够对IL-6、TNF-α表达起到有效缓解作用，而200 mg·kg-1的GTP2干预可显著抑制IL-6、TNF-α含量，对被动吸烟小鼠肺部的炎症反应有很好的干预作用。

2.5 对小鼠肺部炎性相关基因表达水平的影响

IL-6、IL-33、TNF-α及IL-1β基因表达水平升高会导致COPD、肺癌等肺部疾病的发生及发展。以β-actin为内参，由图4的qRT-PCR分析结果可知：与C比较，M组小鼠肺组织IL-6、IL-33、TNF-α及IL-1β基因mRNA相对表达量均显著上升（＜0.05），GTP2组、GTP1组IL-6、IL-33、TNF-α及IL-1β基因mRNA相对表达量显著降低（＜0.05），GTP2组的GTP干预效果与C组表达水平接近。由此可知，导致肺部炎性基因表达增强，茶多酚干预呈剂量依赖关系，以200 mg·kg-1的GTP2干预抑制修复效果明显。

表2 各组小鼠血清中T-SOD、MDA、GSH-Px指标变化

注：*同C组比较；#与M组比较；＜0.05差异显著。

Note: *Compared with C group, # Compared with M group,<0.05 showed significant difference.

表3 各组小鼠血清中IL-6、TNF-α浓度变化

注：*同C组比较；#与M组比较；＜0.05差异显著。

Note: *Compared with C group, # Compared with M group,<0.05 showed significant difference.

注：*同C组比较；#与M组比较；P＜0.05差异显著。

3 讨论

研究表明，高于500 mg·kg-1的EGCG摄入会对小鼠肝脏产生毒性[9]，由于EGCG占茶叶中总儿茶素的50%左右，而儿茶素占茶多酚总量的但70%，所以低于1 428 mg·kg-1的GTP摄入在小鼠安全计量范围之内。本研究选用100 mg·kg-1、200 mg·kg-1GTP对小鼠被动吸烟2个月后进行灌喂干预，灌喂剂量远低于最大耐受剂量，在安全剂量范围。

本实验表明，被动吸烟导致小鼠肺组织充血浮肿、肺泡腔变大、肺泡间隔厚度增加，发生SOD、过氧化氢酶（Catalase，CAT）系列氧化损伤，与K K Campos、K H Chan等研究结果一致[3-4]。灌喂200 mg·kg-1GTP进行干预，体重有所回升，肺部外观形态得到了较好修复，基本恢复到正常对照组水平。GTP干预组与M组比较，小鼠血清中T-SOD、GSH-Px活性明显增加，MDA、IL-6、TNF-α水平明显降低，说明血清抗氧化应激能力增强。但K H Chan等[4]将小鼠进行烟雾暴露后进行绿茶干预得到了相反研究结果，因其使用绿茶剂量过少，GTP起到促氧化作用而未起到应有的保护作用。赵文红等[10]使用茶多酚修复了直链烷基苯磺酸钠致小鼠的皮肤损伤，G Adikesavan等[11]使用EGCG稳定线粒体酶抑制CS诱发大鼠心肌功能障碍细胞凋亡；对CSC毒理性能研究方面，K Matsunaga 等[8]发现EGCG单体可显著抑制CSC诱导巨噬细胞诱导IL-6和TNF-α的产生，C Qing及D N Syed等发现EGCG可保护人正常支气管上皮细胞氧化损伤[6]、抑制NF-κB的活化[7]，上述研究均与本实验取得了一致性研究进展。本研究使用的GTP其EGCG含量为50%，对被动吸烟小鼠进行灌喂干预，与哮喘过敏相关的IL-33、炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α的mRNA表达水平下降接近正常对照组水平；从肺部病理形态改变上分析，GTP也起到了很好修复作用。

绿茶因其富含多酚类物质具有很强的抗氧化性[4, 12]，是深受世界各地人们欢迎、每天饮用的饮料。妇女、儿童本身不吸烟，但常常暴露于被动吸烟环境，使得新生儿体重偏低、胸围偏小，并给呼吸系统带来不良影响[6]。小鼠怀孕期间CS暴露使得新生儿出生时身长、体重降低，肺组织发生炎性变化，导致氧化还原指标失衡[3]。用龙井茶绿茶水提物对CS暴露小鼠进行灌喂干预，发现通过绿茶的抗氧化作用可缓解小鼠气道局部氧化应激及蛋白酶/抗蛋白酶失衡[13]。饮用绿茶、口服EGCG可预防及缓解CS诱导慢性阻塞性肺疾病发生[14]；利用黏膜培养模型发现EGCG是DNA的最好保护物质，对上呼吸消化道细胞中致癌物诱导的DNA断裂起到明显的保护作用[15]。由此可知，饮用绿茶或口服适量EGCG对呼吸道或肺部的烟雾暴露可起到明显的抗氧化保护作用。但从世界公共卫生角度分析，禁烟和避免被动吸烟才是提高生活质量，保证身体健康的根本途径。

[1] 周世伟, 李淑敏, 叶明, 等. 香烟主测流烟雾中主要致癌成分分析[J]. 中国卫生检验杂志, 1991, 1(1): 20-23.

[2] S H Huang, K P Weng, S M Huang, et al. The effects of maternal smoking exposure during pregnancy on postnatal outcomes: A cross sectional study [J]J Chin Med Assoc, 2017, https://doi.org/10.1016/j.jcma.2017.01.007.

[3] K K Campos, V A Dourado, M F Diniz, et al. Exposure to cigarette smoke during pregnancy causes redox imbalance and histological damage in lung tissue of neonatal mice [J]. Exp Lung Res, 2014, 40(4): 164-171.

[4] K H Chan, S P Ho, S C Yeung, et al. Chinese green tea ameliorates lung injury in cigarette smoke-exposed rats [J]Respir Med, 2009, 103(11): 1746-1754.

[5] P Baumeister, M Reiter, N Kleinsasser, et al. Epigallocatechin-3-gallate reduces DNA damage induced by benzo[a]pyrene diol epoxide and cigarette smoke condensate in human mucosa tissue cultures [J]Eur J Cancer Prev, 2009, 18(3): 230-235.

[6] 卿春华, 陈平, 向旭东. 茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响[J]. 中南大学学报(医学版), 2010, 35(2): 123-128.

[7] D N Syed, F Afaq, M H Kweon, et al. Green tea polyphenol EGCG suppresses cigarette smoke condensate-induced NF-kappaB activation in normal human bronchial epithelial cells [J]Oncogene, 2007, 26(5): 673-682.

[8] K Matsunaga, T W Klein, H Friedman, et al. Epigallocatechin gallate, a potential immunomodulatory agent of tea components, diminishes cigarette smoke condensate-induced suppression of anti-Legionella pneumophila activity and cytokine responses of alveolar macrophages [J]Clin Diagn Lab Immunol, 2002, 9(4): 864-871.

[9] LAMBERT J D, KENNETT M J, SANG S M, et al. Hepatotoxicity of high oral dose (-)-epigallocatechin-3-gallate in mice [J]. Food Chem Toxicol, 2010, 48(1): 409-416.

[10] 赵文红, 崔慧娴, 孙倩男, 等. 茶多酚对直链烷基苯磺酸钠致小鼠皮肤损伤的保护作用[J]茶叶科学, 2016, 36(5): 461-468.

[11] G Adikesavan, M M Vinayagam, L A Abdulrahman, et al. (-)-Epigallocatechin-gallate (EGCG) stabilize the mitochondrial enzymes and inhibits the apoptosis in cigarette smoke-induced myocardial dysfunction in rats [J]Mol Biol Rep, 2013, 40(12): 6533-6545.

[12] G J Du, Z Zhang, X D Wen, et al. Epigallocatechin Gallate (EGCG) is the most effective cancer chemopreventive polyphenol in green tea [J]Nutrients, 2012, 4(11): 1679-1691.

[13] K H Chan, S C Chan, S C Yeung, et al. Inhibitory effect of Chinese green tea on cigarette smoke-induced up-regulation of airway neutrophil elastase and matrix metalloproteinase-12 via antioxidant activity [J]. Free Radic Res, 2012, 46(9): 1123-1129.

[14] 黄翔翔, 杨哲, 禹利君. 绿茶、EGCG预防及缓解香烟烟雾诱导COPD的研究进展[J]. 茶叶科学, 2017,37(4): 332-338

[15] P Baumeister, M Reiter, N Kleinsasser, et al. Epigallocatechin-3-gallate reduces DNA damage induced by benzo[a]pyrene diol epoxide and cigarette smoke condensate in human mucosa tissue cultures[J]. Eur J Cancer Prev, 2009, 18(3): 230-235.

Effects of Green Tea Polyphenols on Oxidative Stress Induced by Passive Smoking in Mice Lung

SHI Chunlin1, LI Xiaohuan2, HUANG Xiangxiang2*

1. The High School Attached to Hunan Normal University, Changsha 410006, China; 2. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

The objective of the study is to investigate the intervention effects of green tea polyphenols (GTP) on oxidative stress induced by passive smoking in mice lung and its possible mechanisms. Forty healthy Kunming mice (female) were randomly divided into 4 groups including normal control group (C), passive smoking model group (M), GTP treated group 1 (GTP1, 100 mg·kg-1) and GTP treated group 2 (GTP2, 200 mg·kg-1) respectively (n=10). All mice were killed after treating with GTP for 12 weeks. The morphology and quality of lung, the oxidative stress of serum and inflammatory level were determined. The mRNA expression levels of inflammation-related genes including interleukin 6 (IL-6), interleukin 33 (IL-33), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 1 beta (IL-1β) were measured by fluorescence quantitative PCR. Compared to M group, the life quality and pulmonary morphology of mice in GTP1 and GTP2 were significantly improved, and T-SOD and GSH-Px activities in serum were also significantly enhanced.But MDA, IL-6 and TNF-α levels in serum were decreased significantly. The mRNA expressions of IL-6, IL-33, TNF-α and IL-1β were also declined in GTP groups, which were clearly dose-dependent. These results showed that GTP could protect lung against damage of passive smoking and remain the integrity of lung tissuesby inhibiting inflammatory cytokine expression and improving the antioxidant capacity.

green tea polyphenols, passive smoking, lung tissue, oxidative stress

TS272.5+1；R97

A

1000-369X(2018)02-212-09

2017-09-07

2017-10-30

湖南师范大学附属中学自主研究性学习项目、湖南省植物功能成分利用协同创新项目（HNCR-2014003）

史春麟，男，湖南师范大学附属中学2016级学生。

huangxiangxiangsg@qq.com