张永恒，万思卿，陈江飞，王伟东，周天山，肖斌，杨亚军,2*，余有本*



茶树、基因的克隆及在非生物胁迫中的响应

张永恒1，万思卿1，陈江飞1，王伟东1，周天山1，肖斌1，杨亚军1,2*，余有本1*

1. 西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100； 2. 中国农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心/农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008

蔗糖非酵解型蛋白激酶（SnRK）是一类广泛存在于植物体内的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，其中SnRK2家族在植物非生物胁迫响应过程中起着十分重要的作用。为了探究茶树家族基因响应逆境的分子机制，本研究克隆了两个茶树SnRK2家族基因，并分别命名为（GenBank登录号：MG026837）和（GenBank登录号：MF662805），生物信息学分析表明和分别编码358个和337个氨基酸，与拟南芥和玉米SnRK2蛋白激酶的同源性很高，均具有保守的ATP结合位点和Ser/Thr激酶活性结构域。在高盐、干旱和ABA胁迫下，均能被诱导表达，且呈现先升后降趋势，而在低温和高温胁迫下表达量变化不大；能强烈响应高盐胁迫，也能被高温诱导上调表达；表明它们可能与茶树抗逆密切相关。

茶树；SnRK2s；克隆；非生物胁迫

蛋白激酶在植物的生长发育过程中发挥着十分重要的功能，广泛参与植物细胞分化、物质能量代谢以及逆境响应等一系列生理活动[1]。蔗糖非酵解型蛋白激酶（Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase，SnRK）是一类广泛存在于植物体内的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，根据其结构特点和功能可分为SnRK1、SnRK2、SnRK3三个家族[2]，其中SnRK2家族是植物中特有的蛋白激酶，在植物遭受逆境胁迫时起至关重要的作用。在玉米[3]、烟草[4]、小麦[5]、葡萄[6]、杨树[7]等植物中，均广泛参与了非生物胁迫的响应，且其表达水平与植物的抗逆能力密切相关[8]。譬如，过表达甘蔗的转基因烟草的抗旱性显著提升[9]，过表达杨树和能大幅度增加拟南芥的耐盐能力[10]，过表达小麦的拟南芥具有抗低温、高盐、干旱等多种抗性[11]。

植物应答逆境胁迫的过程十分复杂，涉及多种信号通路，根据是否有ABA参与可分为ABA依赖途径和ABA非依赖途径[12]。SnRK2在ABA依赖途径和ABA非依赖途径中均发挥重要调控作用，如在过表达的转基因拟南芥中，通过ABA非依赖途径，增强了转基因植株的耐旱、耐低温能力[13]；在干旱条件下能响应体内ABA信号，调控气孔的关闭减少失水，增加拟南芥的抗旱能力[14]。目前，SnRK2参与ABA非依赖途径的分子机制尚不清楚；而在ABA依赖途径中，SnRK2蛋白激酶被证实为核心调控因子：当植物遭受逆境胁迫时，ABA在细胞内快速积累，ABA受体特异性地感知ABA信号并与之结合，形成ABA-PYR/PYL/ RCAR复合体，该复合体进一步与A型PP2C结合，促使SnRK2激酶与PP2C分离，SnRK2的活性得以释放。活性状态下的SnRK2蛋白激酶能激活下游转录因子ABF/AREB或离子通道，诱导ABA应答基因的表达，从而增强植物抵抗逆境的能力[15-17]。

茶树是我国重要的叶用经济作物，近年来部分茶区低温、干旱等极端天气频发，茶叶产量和品质严重受损，比如，2013年夏天罕见的高温干旱使浙江省13.86万hm2茶园遭受危害，经济损失达到17.2亿元[18]。所以探究茶树的抗逆机制，培育新型抗逆茶树品种迫在眉睫。然而，与其他植物相比，茶树非生物胁迫方面的研究还比较薄弱，迄今还未见关于茶树家族基因功能的研究报道。本研究克隆了两个茶树家族基因，并分析了它们在多种胁迫下的表达模式，以期为深入研究基因在茶树非生物胁迫中的响应机制提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理方法

试验材料为培养于西北农林科技大学科研温室的一年生龙井长叶茶树品种水培茶苗，培养条件为白天25℃，晚上22℃，自然光照；选取生长健壮，长势一致的茶苗分别用ABA（100 μmol·L-1），NaCl（200 mmol·L-1），20% PEG 6000，4℃，38℃处理；ABA处理时，先将ABA溶于少量95%乙醇，然后用蒸馏水配制成终浓度为100 μmol·L-1的溶液，均匀喷洒在水培茶苗叶片上，在处理后0、2、4、8、12、24 h时从至少3株茶苗幼嫩枝条顶端分别取2~3片幼嫩叶片混合后分成3份；PEG和NaCl处理时，向培养液中加入固体PEG和NaCl，搅拌至完全溶解后，将茶苗的根部完全浸没在培养液中进行盐胁迫和模拟干旱处理，在处理后0、2、4、8、12、24 h时按照ABA处理后同样的方法进行取样；高温、低温处理在光照培养箱中进行，当温度达到设定值时迅速将水培茶苗移至光照培养箱中，在处理后0、2、4、8、12、24 h时按照ABA处理后同样的方法进行取样。另采集多株未处理水培茶苗的根、茎、叶和花等组织，所有样品液氮速冻后保存于–80℃，用于提取RNA。

1.2 SnRK2基因的克隆

采用CTAB法提取茶树叶片总RNA[19]，–80℃保存。cDNA第一链合成按照5×All-In-One RT MasterMix试剂盒（abm，加拿大）说明书进行。

根据转录组数据，分别设计两对基因特异性引物（表1），以cDNA第一链为模板，进行PCR扩增；PCR扩增条件为：94℃、5 min；94℃、30 s，59℃、30 s，72℃、100 s，35个循环；72℃后延伸5 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，目的片段按照PCR纯化试剂盒Gel Extraction Kit（OMEGA，美国）进行回收，连接到pMDTm19-T Vetor（TAKARA，大连宝生物），然后转化至大肠杆菌，挑选阳性单克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

1.3 生物信息学分析

利用NCBI中的ORF finder进行ORF的查找和编码氨基酸的推导；用ProtParam tool进行蛋白相对分子量及理论等电点的分析，用NetPhos 3.1 Server进行蛋白的磷酸化位点预测；用ProtScale分析疏水性，用WoLF PSORT进行蛋白亚细胞定位预测，用DNAMAN7.0进行多序列比对，用MEGA7.0进行进化树的构建。

表1 引物序列

1.4 实时荧光定量PCR分析

2 结果分析

2.1 基因克隆及序列分析

以龙井长叶茶树叶片cDNA为模板，用特异性引物F/R和F/R进行PCR扩增，分别得到长度为1 373 bp（图1-A）和1 164 bp（图1-B）的片段；测序结果表明，这两条序列与本课题组转录组数据一致，将两条序列提交到NCBI，登录号分别为MG026837（）和MF662805（）。ORF finder分析表明的ORF框为1 077 bp，编码358个氨基酸；的ORF框为1 014 bp，编码337个氨基酸。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 同源比对和系统发育分析

将和的ORF序列在NCBI中分别进行BLASTX比对，结果表明它们都属于SnRK2家族，并且与其他物种的SnRK2家族成员具有高度的相似性，其中与葡萄SRK2A（XP_002269221.1）、苹果SnRK2.9（NP_001306943.1）、马铃薯SnRK2.4（NP_001274892.1）、烟草SRK2A（NP_001312448.1）等物种的SnRK2成员相似性均高达90%以上；与木薯SAPK2（XP_021600376.1）、麻风树SAPK2（XP_012067903.1）等物种的SnRK2成员相似性也分别达到87%和85%。

注：M. marker, A. CsSnRK2.1扩增产物，B. CsSnRK2.2扩增产物。

图2 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2进化分析

图3 茶树CsSnRK2.1和CsSnRK2.2与其他植物SnRK2s的氨基酸序列比对

将和的氨基酸序列与拟南芥和水稻SnRK2家族成员的氨基酸序列在MEGA7.0中采用邻接法进行系统发育分析，结果表明与Group 1成员AtSnRK2.10和AtSnRK2.4聚在一簇，与Group 2成员AtSnRK2.8聚在一簇（图2），表明它们分别属于Group 1和Group 2家族，对比它们的氨基酸序列，发现它们在N端相似性很高，均含有保守的ATP结合位点DXGXGNFGVAXL和Ser/Thr激酶活性结构域（活化环）KICDFGYSKSXXXHGXPK（图3）。

2.2.2 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2蛋白磷酸化位点预测

SnRK2s蛋白属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，因此其活性受到丝氨酸/苏氨酸的磷酸化调控。在NetPhos 3.1 Server中对两个蛋白进行磷酸化位点预测，结果表明，两个蛋白中均含有大量的磷酸化位点。有磷酸化位点29个，其中丝氨酸位点14个，苏氨酸位点9个，酪氨酸位点6个（图4-A）；有磷酸化位点27个，其中丝氨酸位点15个，苏氨酸位点6个，酪氨酸位点6个（图4-B）。

2.2.3和蛋白亲水/疏水性分析及亚细胞定位预测

用ProtScale结合ProtParam tool对和进行亲水/和疏水性分析，结果如图5所示。从图中可以看出，和均为亲水蛋白，其中的平均疏水系数为–0.608，在191和192号氨基酸位置出现最大亲水系数2.189，在335号氨基酸位置出现最小亲水系数–3.5（图5-A）；而平均疏水系数为–0.275，同样在191和192号氨基酸位置出现最大亲水系数，而最小亲水系数则出现在40号氨基酸位置（图5-B）。另外，WoLF PSORT中亚细胞定位预测定位于胞质骨架上，而定位到细胞质中。

图4 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2磷酸化位点预测

2.3 茶树不同组织中CsSnRK2.1和CsSnRK2.2的表达分析

实时荧光定量结果表明，在嫩叶中表达量最高，其次是根，在花中表达量最低；而在根和叶片表达量相当且最高，其次是花，在茎中表达量最低（图6）。

2.4 非生物胁迫对CsSnRK2.1和CsSnRK2.2的表达分析

荧光定量PCR法分析了非生物胁迫后两个基因表达水平的变化情况，结果如图7所示。从图中可以看出，两个基因在不同逆境胁迫下的表达模式有较大差异。

2.4.1 NaCl胁迫对茶树基因表达的影响

从图7-A中可以看出，NaCl处理后，和的表达量均呈现先升后降的趋势，峰值均出现在2 h时左右；但各时间段的表达水平明显高于，且在8 h后就降至正常值，而仍然稳定在处理前2倍左右。

图5 CsSnRK2.1和CsSnRK2.2蛋白亲/疏水性分析

注：误差线表示3次生物学重复的标准误差。

2.4.2 温度胁迫对茶树基因表达的影响

从图7-B和图7-C中可以看出，高温（38℃）胁迫24 h内，的表达量没有较大变化，而的表达量在8 h开始上升，12 h达到处理前2.5倍左右，然后又回落到处理前水平；低温胁迫后，的表达量呈先升后降趋势，4 h表达量最高，约为胁迫前的2.5倍左右，而对低温似乎不敏感，仅在4 h时小幅上调。

注：误差线表示3次生物学重复的标准误差

2.4.3干旱胁迫和ABA处理对茶树基因表达的影响

用20% PEG6000处理模拟干旱胁迫后，的表达量在24 h内都比较稳定，而的表达被强烈诱导，8 h达到峰值，约为处理前6倍左右（图7-D）。

从图7-E可知，ABA处理后，的表达不能被诱导，的表达量在2 h时上升至处理前的2.5倍左右，然后逐渐下降，12 h恢复到处理前水平。

3 讨论

SnRK2是植物响应非生物胁迫的关键调控因子[8]，对它的研究有利于进一步揭示植物抗逆机制。目前SnRK2家族成员功能的研究主要集中在拟南芥、水稻、玉米等模式植物，而茶树SnRK2家族成员的功能及其分子机制还有待研究。本研究从茶树品种中克隆得到了两个SnRK2基因，它们编码的氨基酸序列与其他物种的SnRK2成员具有较高同源性，尤其是N端的ATP结合位点和活化环区域。目前已经鉴定出了很多SnRK2的关键磷酸化位点，如拟南芥AtSnRK2.6[21]活化环中的Ser175，AtSnRK2.10[22]活化环中的Ser158，它们与激酶活性密切相关。和活化环内的158位氨基酸均为Ser，与AtSnRK2.10一致，表明和的激酶活性可能也与Ser158密切相关。

已有的研究表明SnRK2家族基因广泛参与植物的逆境响应过程[11,23-24]。本研究的结果亦证实和与茶树的逆境响应密切相关。在盐胁迫下，和的表达量均出现先升高后降低的变化，说明它们参与了茶树对盐胁迫的响应；而的表达量始终高于，表明它们对盐胁迫的响应程度不同，这与马铃薯[25]、棉花[26]等作物中的研究结果相同；另外，拟南芥中和均被证实在盐胁迫下能维持根部的生长及稳定性[27]，系统进化树表明与和亲缘关系最近，推测在盐胁迫下也可能与茶树根部的生长相关。植物体内往往有多个基因能被PEG激活，但它们响应PEG的快慢及受诱导程度有很大区别[28-29]。本研究中能迅速、强烈且持续地被PEG诱导上调表达，表明它在茶树应对干旱胁迫过程中发挥了重要作用，的表达量在24 h时上升至处理前2倍，但24 h后其表达量变化情况还有待进一步研究。和受低温诱导后都仅在4 h时上调表达，而在烟草[4]、小麦[30]等作物中与低温密切相关的基因都被持续诱导，说明茶树中和很可能不是响应低温胁迫的关键基因。在高温胁迫下，的表达量相对稳定，表明它不响应高温胁迫；而的表达量出现先升高后降低的趋势，与玉米[31]在高温胁迫下的表达趋势相同，推测它可能参与了茶树对高温的响应过程。

SnRK2参与非生物胁迫的信号通路可以分为ABA依赖途径和ABA非依赖的两种途径[12]。Kobayashi等[15]研究表明10个水稻成员均受到高渗透胁迫的诱导，但只有Group 3亚家族成员（、和）能被ABA诱导；拟南芥的10个SnRK2成员中也只有Group 3亚家族成员（、和）能被ABA强烈激活[32]。本研究中和分别属于Group 1、Group 2亚家族；ABA处理24 h内，的表达量始终没有明显变化，说明它可能与小麦[11]、烟草[24]等作物中Gorup 2亚家族成员一样，主要是通过ABA不依赖途径参与植物抗逆反应；而能被ABA诱导上调表达，与拟南芥、水稻的研究结果不一致，但杨树[7]中Gorup 1亚家族成员基因也能被ABA诱导上调表达，说明家族基因Group 1亚家族成员对ABA的响应可能具有物种特异性。然而茶树是否参与了ABA依赖的信号途径、其分子机制如何仍不清楚，这将是后期的研究重点。

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Cloning and Expression Analysis ofandGenes in Tea Plant () under Abiotic Stress

ZHANG Yongheng1, WANG Siqing1, CHEN Jiangfei1, WANG Weidong1, ZHOU Tianshan1, XIAO Bin1, YANG Yajun1,2*, YU Youben1*

1. College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Tea Research Institute of Chinese Academy, Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Sucrose non-fermenting-1-related protein kinase (SnRK) is a kind of serine/threonine protein kinases widely exist in plants. Among them, members of SnRK2 family play a vital role in plant response to stresses. In order to investigate the molecular mechanisms ofin response to abiotic stresses, twogenes from tea plant were cloned and named as(GenBank accession code: MG026837) and(GenBank accession code: MF662805) respectively. Bioinformatics analysis showedthat they contained 358 and 337 amino acids respectively, which harbored a conserved ATP binding site and Ser/Thr kinase domain and were highlysimilar to SnRK2 protein kinase ofand maize. The expression ofwas transiently induced and then decreased by high salinity (100 mmol·L-1NaCl), drought (20% PEG6000) and ABA(100 μmol·L-1) stress, but showed no significant changes under low (4℃) or high temperature treatments (38℃).By contrast,was strongly induced by high salt and temperature treatments. The results revealed thatandmight be closely related to stress responses in tea plant.

tea plant (), SnRK2s, cloning, abiotic stress

S571.1；Q52

A

1000-369X(2018)02-183-10

2017-06-05

2017-08-01

国家茶叶产业技术体系、汉中综合试验站（CARS-23）、陕西省农业专项资金项目（tg2015-099）、中国博士后科学基金面上项目（2016M602873）

张永恒，男，硕士研究生，主要从事茶树分子育种研究。