张玥，胡雲飞，王树茂，柯子星，林金科



茶树儿茶素合成相关MYB转录因子生物信息学分析

张玥，胡雲飞，王树茂，柯子星，林金科*

福建农林大学安溪茶学院，福建 福州 350002

从茶树（）转录组数据库中获得6个与儿茶素合成相关的MYB转录因子，对其进行蛋白理化性质与结构功能预测、核定位信号和蛋白保守结构域分析，通过同源分析构建系统发育树。结果表明，与儿茶素合成相关的6个MYB蛋白都属于亲水性的非分泌蛋白，定位在叶绿体、线粒体和细胞核上，其空间结构主要是α-螺旋和β-转角；保守结构域的分析发现除了comp159173_c0基因，其余5个都属于SANT超家族基因成员。系统进化树显示6个MYB蛋白形成4个分支，显示出各自间较远的亲缘关系。差异表达分析的结果进一步证实了6个MYB转录因子与儿茶素合成代谢的相关性。

儿茶素；MYB转录因子；生物信息学

茶叶中的儿茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，是茶树中最主要的黄烷醇类化合物，属于类黄酮物质[1]。儿茶素含量占茶树鲜叶干重的12%~25%，是茶叶中多酚类物质的主体成分，它们既是决定茶叶品质的关键因素，也是茶叶抗癌、抗炎症等保健功效的主要成分[2]。近年来，随着茶叶保健功效的阐明，对茶树儿茶素和原花色素的生物合成途径及分子调控机理的研究已成为国内外茶树次生代谢领域研究的热点。

转录因子是一类植物中普遍存在的调节蛋白，又称为反式作用因子，即通过识别或结合真核基因启动子区域中的顺式作用元件，来激活或抑制靶基因的转录，在植物的生长发育[3-5]、生物与非生物胁迫应答[6-7]、激素应答[8]、次生代谢[9-11]等过程中起到调节和控制的作用。MYB类转录因子在植物的次生代谢中主要在苯丙素代谢途径中发挥作用，该途径的起始物质莽草酸通过莽草酸途径产生苯丙氨酸，苯丙氨酸又在限速酶苯丙氨酸解氨酶的作用下，产生许多不同的次级代谢产物，包括儿茶素类化合物[12]。

迄今为止，茶树儿茶素合成途径中一些关键酶的基因已经被克隆，例如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）、查尔酮合成酶（CHS）、二氢黄酮醇还原酶（DFR）、花青素还原酶（ANR）、花青素合成酶（ANS）、黄烷酮3-羟基化酶（F3H）等，并对这些酶与多酚合成之间的关系进行了初步的研究[13-17]。但儿茶素类化合物的种类多样，合成途径受到大量关键酶基因的影响，而这些酶基因的表达则受到相应转录因子的调控[18]。

诸多调控类黄酮次生代谢的MYB转录因子在植物中被发现。前期的研究在草莓、番茄、苹果、土豆等植物中分离并克隆得到了调控花青素合成途径的MYB蛋白[19-22]，在豆科植物、柿树、杨树等植物中分离克隆得到了调控原花色素合成代谢的MYB转录因子[23-25]，在拟南芥和葡萄中还克隆得到了一些调控黄酮醇代谢途径的MYB转录因子[26-28]，最近的研究发现导入MYB、bHLB还可以激活黄烷醇类次生代谢途径上结构基因的表达[29]。茶树中关于类黄酮合成相关MYB转录因子的研究主要集中在对花青素合成代谢相关途径的调控[30-31]，对儿茶素合成相关的MYB转录因子的功能研究则未见报道。本研究在前期对高酯型儿茶素转录组信息分析的基础上，对之前课题组筛选出的6个与儿茶素总量、酯型儿茶素含量的关联系数均在0.75以上的MYB转录因子[32]，采用生物信息学的方法，分析其蛋白质理化性质、进化关系、结构功能以及差异表达模式，为进一步研究茶树儿茶素合成过程中相关的MYB转录因子功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

茶树MYB序列来源于本课题组构建的转录组数据库（NCBI：SRP059658），通过基因功能注释和前期“茶树芽叶儿茶素含量与转录因子MYB、bHLH关联分析”[32]的研究，获得6条与儿茶素总量、酯型儿茶素含量关联系数均在0.75以上的MYB蛋白基因（表1）。

1.2 方法

1.2.1 茶树儿茶素合成相关MYB转录因子生物信息学分析

利用在线工具ProtParam （http：//web.expasy. org/protparam）对其进行理化性质分析，并用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）在线数据库分析其二级结构。通过SWISS- MODEL（https://www.swissmodel. expasy.org）数据库进行MYB蛋白三维结构的同源建模预测，登录SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP）完成MYB蛋白的信号肽分析，采用TargetP-1.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP）和BaCello（http://gpcr.biocomp. unibo.it/bacello）在线数据库进行亚细胞定位分析；通过NCBI served Domains 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）在线分析MYB蛋白保守结构域。

表1 基于转录组筛选的与儿茶素合成相关的茶树MYB序列

注：“-”基因功能未注释。Note: Gene function was not annotated.

表2 茶树儿茶素合成相关MYB蛋白理化性质

1.2.2 茶树儿茶素合成相关MYB转录因子同源性分析

通过NCBI数据库的Blast工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对茶树儿茶素合成相关的6个MYB转录因子氨基酸序列进行同源性比对，使用DNAMAN构建6个MYB转录因子的系统进化树。

1.2.3 茶树儿茶素合成相关MYB转录因子差异表达分析

参照GB/T 8318—2008茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法，对高酯型儿茶素新品系“1005”（E）及其父本黄旦（M）、母本福云七号（F）的芽头、二叶、四叶进行儿茶素含量检测，并对其进行杂交优势分析。

中亲优势=（E－双亲均值）/双亲均值Í100%

超亲优势=（E－高亲本值）/高亲本值Í100%

负向超亲优势=（E－低亲本值）/低亲本值Í100%

利用高酯型儿茶素新品系“1005”（E）及其父本黄旦（M）、母本福云七号（F）不同发育时期的鲜叶转录组数据，分析6个与儿茶素合成相关的MYB基因在茶树叶片不同发育时期的表达差异，以及在亲代遗传上的表达规律。

2 结果与分析

2.1 茶树儿茶素合成相关MYB转录因子理化性质分析

采用Open Reading Frame Finder将6个MYB转录因子的cDNA序列翻译成氨基酸，利用ProtParam分析MYB蛋白的理化性质，结果见表2。6个与儿茶素合成相关的MYB转录因子蛋白相对分子量在8~53 ku之间，其中comp150334_c1、comp130756_c0、comp109329_c0和comp159173_c0 4个为酸性蛋白（理论等电点<7），comp143073_c0和comp166178_c0为碱性蛋白（理论等电点>7）。稳定性分析发现，comp166178_c0的不稳定指数为38.36，小于40，判定其为稳定蛋白[33]，其余均为不稳定蛋白（Ⅱ>40）。平均亲水指数均小于0，说明6个MYB蛋白均为亲水性蛋白。

2.2茶树儿茶素合成相关MYB转录因子二、三级结构预测

蛋白的生物功能除了受氨基酸序列的影响之外，其空间结构通常也可以帮助我们理解蛋白质的功能单位。利用PSIPRED在线数据库对茶树6个与儿茶素合成相关的MYB转录因子基因编码的氨基酸序列进行二级结构的预测（图1），发现这些基因编码的蛋白二级结构基本都是由α-螺旋和无规则的卷曲组成，其中comp150334_c1、comp143073_c0、comp130756_c0、comp109329_c0和comp166178_c0编码的蛋白二级结构中α-螺旋（Helix）比例分别为24.54%、11.31%、38.38%、41.49%、53.33%，无规则卷曲（Disordered）所占的比例分别为75.46%、83.74%、61.62%、58.11%、46.67%，在comp143073_c0编码的蛋白中发现有4.95%的β-折叠（Sheet）。在comp159173_c0中仅发现3个构成α-螺旋的氨基酸残基，7个构成β-折叠的氨基酸残基，其余均为无规则的卷曲，占到氨基酸总量的91.53%。登录swiss-model数据库，对6个基因编码的氨基酸序列进行同源建模预测分析，预测得到的蛋白3D模型如图2，其构象与蛋白的理化性质和二级结构预测结果一致。

图1 茶树儿茶素合成相关MYB蛋白二级结构

图2 茶树儿茶素合成相关MYB蛋白空间构象

2.3茶树儿茶素合成相关MYB转录因子信号肽与亚细胞定位分析

信号肽是指位于分泌蛋白N端的一段由15~30个氨基酸残基组成的疏水性短肽链，其功能主要是引导蛋白质多肽链完成跨膜转移。通过信号肽的分析不仅可以判断一个蛋白质是否为分泌蛋白，还能推测一个蛋白质或新生肽链的细胞定位。利用SignalP 4.1 Server数据库分析本研究涉及的6条蛋白质序列，按照默认的神经网络模型和隐马尔可夫模型进行信号肽分析，结果显示全部6条序列均不存在信号肽，属于非分泌蛋白，即6个MYB蛋白均在细胞内完成相关生物功能。

为进一步研究这些蛋白在细胞内的分布，采用TargetP在线数据库对6条氨基酸序列进行亚细胞定位分析，结果显示comp143073_c0和comp159173_c0编码的蛋白定位在叶绿体的概率为0.64和0.765，其余4个基因定位在其他细胞器（表3）。采用BaCello进一步进行定位分析，结果显示这4个基因编码的蛋白质均定位在细胞核上。信号肽预测和亚细胞定位分析的结果均排除了这6个基因编码的蛋白为分泌蛋白，在细胞外发挥作用的可能，预测其在细胞内完成相关生物学功能。

表3 茶树儿茶素合成相关MYB蛋白亚细胞定位

注：置信度分类从1到5，1表示最高的预测可靠度，difference>0.8; 2: 0.8>difference>0.6; 3:0.6>difference>0.4; 4: 0.4>difference>0.2; 5: 0.2>difference。定位：C叶绿体；M线粒体；_其他任何位置；*未知位置。

Note: Confidence level ranged from 1 to 5, and 1 shows the highest predicted reliability, difference>0.8. 2: 0.8>difference>0.6. 3:0.6>difference>0.4. 4: 0.4>difference>0.2. 5: 0.2>difference. Location: C, Chloroplast. M, Mitochondria. _, Other location.*, Unknown location

2.4茶树儿茶素合成相关MYB转录因子保守基序分析

利用NCBI 序列分析工具Open Reading Frame Finder分析6条MYB基因的蛋白序列，将翻译出的蛋白序列进行BLASTP同源比对，对MYB蛋白进行保守基序的分析（图3）。结果显示在comp150334_c1、comp143073_c0、comp109329_c0和comp166178_c0均发现1~2个高度保守的SANT结构域（SWI, ADA, N-CoR and TFIIIB），说明这4个MYB转录因子都属于典型的SANT家族基因。在comp150334_c1氨基酸序列的第9~125位置发现一个REB结构域，属于MYB超家族蛋白；在comp143073_c0氨基酸序列的第106~151位置发现一个COG结构域，为组蛋白乙酰转移酶复合物（SAGA/ADA）亚基ADA的保守结构域；在comp109329_c0氨基酸序列的第29~68位置发现一个PLN保守结构，该结构为转录阻遏型因子MYB5的保守结构域。另外在comp130756_c0氨基酸序列上发现两个GT1保守结构域，分别位于第98~160和391~456位置，为MYB类转录因子的保守结构域，属于SANT类超家族基因；在氨基酸序列的第241~398位置发现一个PRK结构，该结构为DNA聚合酶III的亚基保守结构域。在comp159173_c0的氨基酸序列中没有发现任何保守基序。

2.5 茶树儿茶素合成相关MYB转录因子同源性分析

将茶树6个与儿茶素合成相关的MYB转录因子蛋白序列通过NCBI在线BLASTP，获得的同源比对结果表明，comp150334_c1与白桦（，AMR97400.1）相似性70%、可可（，EOY03526.1）相似性69%；comp143073_c0与茶树（，AJF46887.1）相似性99%、亚洲棉（，KHG05222.1）相似性78%；comp130756_c0与麻风树（，XP_012089242.1）相似性53%、木薯（，XP_021620176.1）相似性52%；comp109329_c0与橡胶（，XP_021635948.1）相似性96%、核桃（，XP_018813014.1）相似性93%；comp159173_c0与葡萄（，XP_010651953.1）相似性56%、麻风树（，XP_018807434.1）相似性54%；comp166178_c0与其他物种间的相似性均低于50%。由此推测茶树儿茶素合成相关的6个MYB蛋白可能属于不同的亚型，具有较远的亲缘关系。

为进一步探究这6个MYB蛋白的系统进化关系，利用DNAMAN软件构建其系统发育树（图4），6个蛋白序列在进化发育树上形成了4个分支，comp150334_c1和comp109329_c0聚为一类；comp143073_c0与comp159173_c0聚为一类，另外两个蛋白各占据一个分支。结合序列相似性和保守基序的分析可以发现，聚类在一起蛋白comp150334_c1和comp109329_c0拥有大致相同的保守基序位置，在序列相似性上表现较低的两个蛋白自成一簇，推测这两个蛋白的基因可能来自不同的演化途径，其亲缘关系较较远，也有可能是目前可检索到的这两个蛋白的同源序列背景较少。

2.6 茶树儿茶素合成相关MYB转录因子差异表达分析

参照《GB/T 8318—2008茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法》，对高酯型儿茶素新品系“1005”（E）及其父本“黄旦”（M）、母本“福云七号”（F）的芽头、二叶、四叶进行儿茶素含量检测，并对其进行杂交优势分析，结果见表4。在子代“1005”的茶芽和二叶期，酯型儿茶素的含量超出四叶期2.6~3.6倍，儿茶素总量也超出四叶期1.8~2.2倍，同时儿茶素合成的杂交优势也主要体现在茶芽和二叶期。酯型儿茶素在茶树鲜叶发育的各个时期都表现出超高亲和部分超亲的优势，而非酯型儿茶素则表现出负向超亲优势，仅在四叶期表现出部分超亲优势，儿茶素总量的杂交优势同酯型儿茶素的变化类似。

图3 茶树儿茶素合成相关MYB蛋白的保守结构域

图4 茶树儿茶素合成相关MYB蛋白系统进化树

表4茶树新品系“1005”及其父母本鲜叶不同发育时期儿茶素含量与杂交优势

Table4 Catechin contents and heterosis of ‘huangdan’, ‘fuyun 7’ and ‘1005’ tea plant in different leaf developmental stages

注：同一指标中不同小写字母表示差异达到1%显著水平，大写字母表示差异达到0.5%显著水平，“- -”和“-”分别表示负向完全优势和负向中亲优势，“++”和“+”分别表示超亲优势和中亲优势

Note: In the same index, the different alphabet of small letters indicates difference to 1% significant level, and capital letters indicates 0.5%. The items of “--” and “-” indicate negative complete advantage and negative mid-parent heterosis, respectively. The items of “++” and “+” indicate over-parent heterosis and mid-parent heterosis, respectively.

基因决定表型是生物遗传的规律，为了进一步探究儿茶素含量与茶树儿茶素合成相关的6个MYB因子之间的关系，本研究利用转录组数据分析这6个转录因子在茶树叶片不同发育时期的表达差异，用RPKM（Reads Per Kilo bases per Million mapped reads）来估算基因的表达量[34]。

差异表达的结果显示，只有comp166178_c0基因在不同发育时期的表达量无显著差异。进一步分析其余5个基因在子代和父母本的鲜叶不同发育时期的表达差异（图5）发现在茶树嫩芽中，5个MYB转录因子基因在子代“1005”中都表现出超高亲优势。在子代“1005”的二叶中，comp150334_c1基因表现出超高亲优势，而comp109329_c0基因表现出负向完全优势，comp143073_c0、comp130756_c0和comp159173_c0则表现出中亲优势。在第四叶当中的表达分析发现，5个基因在母本福云七号中的表达量显著高于在父本黄旦和子代“1005”中的表达量，comp150334_c1、comp109329_c0和comp159173_c0基因在子代中表现出负向中亲优势，comp143073_c0基因表现出中亲优势，而comp130756_c0基因则表现出负向完全优势。

图5 茶树新品系“1005”及其父母本鲜叶不同发育时期MYB基因表达差异

3 讨论

植物MYB转录因子是一类与调控植物生长发育、生理代谢、细胞形态和模式建成等生理过程相关的转录因子，在植物中普遍存在，同时也是植物中最大的转录家族之一[12]。儿茶素的生物合成是一个极为复杂的过程，受到大量关键酶基因的直接影响，而这些酶基因的表达又受到相应转录因子的调控[18]。本研究基于高通量测序和基因功能分析发现的茶树新品系及其父母本鲜叶不同发育时期与儿茶素合成相关的MYB转录因子基因，利用生物信息学的方法对这些转录因子基因的理化特征、结构功能、进化特征和表达模式进行分析，结果发现6个MYB转录因子都属于亲水性的非分泌蛋白，说明其发挥生物学功能的位置可能在细胞质内，与茶树其他MYB家族蛋白的理化性质类似[35]，其中5个转录因子带有SANT保守位点。SANT结构域的存在揭示了这些MYB蛋白在调控靶标基因时可能是其中一个SANT结构域与靶DNA结合，同时另一个SANT结构域起到蛋白-蛋白相互作用的功能，或者通过SANT结构域进一步增强MYB蛋白与靶标DNA的相互作用[36]。系统进化分析的结果显示这6个MYB蛋白可能属于不同的亚型，推测其在功能上存在较显著的差异，可能涉及到儿茶素代谢途径的全过程。通过分析儿茶素含量和基因表达量之间的关系发现6个MYB转录因子的表达量与儿茶素在鲜叶中的合成量呈正相关，说明这6个MYB转录因子在儿茶素的合成中起到正向调控的作用。

在植物中还存在着MYB、bHLH和WD40 3种蛋白的复合体结构，简称MBW复合体。这些复合体也参与类黄酮物质的生物合成。拟南芥中的MBW复合体TT2/TT8/TTG1能够调控种皮中原花青素的合成[37-38]。在矮牵牛中发现的 AN2/AN1/AN11复合体则通过调控花青素代谢途径中重要的结构基因DFR和CHSJ的表达从而控制花冠中花青素的合成[39-41]。本课题组前期的工作在高酯型茶树新品系“1005”及其父母本不同发育时期的叶片中发现了显著差异表达的MYB和bHLH两类转录因子，但是这些差异表达的基因与儿茶素含量的关联系数却很低，这表明它们可能对儿茶素的合成起到负调控作用或者需要与其他转录因子形成转录复合体协同调节儿茶素的合成代谢[32]。因此，继续深入发掘MYB转录因子及其复合体在儿茶素合成代谢中的功能，进一步认识茶树儿茶素代谢的合成及调控过程，为茶树育种和改良方式提供理论依据，这些将是今后研究的重点。

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Bioinformatic Analysis of MYB Transcription Factors Involved in Catechins Biosynthesis in Tea Plant ()

ZHANG Yue, HU Yunfei, WANG Shumao, KE Zixing, LIN Jinke*

Anxi College of Tea Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

Six MYB transcription factors involved in the biosynthesis of catechins were obtained from the tea plant () transcriptome database. Bioinformatic analysis including the physicochemical properties and structural functions of proteins, nuclear localization signal (NLS), protein conserved domain (PCD) and phylogenetic tree analysis were performed. The results demonstrated that the 6 MYB proteins involved in the biosynthesis of catechins belong to hydrophilic non-secretory proteins and are predicted to be located in the chloroplasts, mitochondria and nucleus. The main spatial structures are α-helixes and β-turns. Except the comp159173_c0, the other 5 genes belong to SANT super-family group based on the PCD analysis. The phylogenetic tree analysis shows that 6 MYB proteins are classified into 4 groups, indicating a distant relationship between them. Differential gene expression analysis further confirmed the close correlation between the 6 transcription factors and the catechin biosynthesis.

catechins, MYB transcription factors, bioinformatics

S571.1；Q946.8

A

1000-369X(2018)02-162-12

2017-10-12

2017-11-03

福建省教育厅中青年教师教育科研项目（JAT170178）、福建农林大学人才引进科研启动基金（KXR15008A）、国家自然科学基金（31170651）

张玥，女，讲师，博士研究生，主要从事茶树分子生物学研究，yaoyao86527@163.com。

ljk213@163.com