张维嘉　林小娟　刘爱国　付士红　刘桂芳　邵楠　王倩莹　陶泽新　何英　雷雯雯

梁国栋　徐爱强　赵丽　王环宇

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一种可引起人类严重神经系统疾病传染病的虫媒病毒。 JEV引起的乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)，主要流行在亚洲、西太平洋地区及澳洲北部地区，每年报告约50 000脑炎病例，病死率高达20%～30%，中国报告病例数几乎占世界范围病例总数的一半[1]。乙脑是我国法定乙类传染病之一，是我国重要的病毒性脑炎疾病，随着乙脑疫苗纳入计划免疫，发患者数显著下降。

山东省历史上是乙脑流行大省，自1986年将乙脑疫苗纳入儿童计划免疫后，发病数逐年下降，但部分地区仍然发生乙脑的暴发疫情[2]，2013年山东省出现乙脑大规模暴发流行，并曾从蚊虫标本中分离得到多株JEV[3-4]。为掌握目前当地蚊虫中携带乙脑情况及目前乙脑毒株变化情况，于2016年在山东省三个地区采集蚊虫标本并分离病毒，对病毒分子特征进行深入分析，结果报道如下。

1　材料与方法

1.1蚊虫标本的采集2016年8—9月在山东省微山县、莒南县、垦利县的猪圈中使用紫外诱蚊灯(“功夫小帅”牌，武汉市吉星环保科技有限责任公司产品)和电动吸蚊器采集蚊虫标本。使用紫外诱蚊灯采集时间为晚上19:00至次日7:00，电动吸蚊器采集时间为日落前至晚上20:00。蚊虫标本在-20 ℃冰箱内冷冻1 h，在冰排上剔除雄蚊，蚊蚡类后按照蚊子形态学特点对雌蚊分类，按照采集地区与蚊虫种类装入冻存管，50～120只/批，冻存保存于液氮罐中。

1.2蚊虫处理与病毒分离从液氮罐中取出装有蚊虫的冻存管，迅速将蚊虫倒入加有5 mm滚珠的2 ml Eppendorf 管中，每管加入1.5 ml 研磨液(含5%青霉素、链霉素、1% 谷氨酰胺的MEM培养液)，在组织震荡仪上以25次/s频率震荡3 min 后以4 ℃，15 000×g离心30 min。取80 μl 研磨上清液感染生长至70%～80%的单层BHK-21和C6/36细胞，吸附1 h后，弃掉上清，加入1 ml细胞维持液，分别置于37 ℃和28 ℃培养箱，逐日观察细胞病变情况。盲传3代，无病变者舍弃。对出现病变的样品继续传代，直至出现规律病变后冻存。

1.3分子生物学检测取140 μl蚊虫研磨上清液，用QIAamp© Viral RNA提取试剂盒(Qiagen公司)提取RNA，利用随机引物p(dN)6 和Ready-to-GoTM You prime First-Strand Beads 试剂盒(GE Healthcare 公司)制备cDNA文库。使用本科室自行设计的JEV 型特异性引物及探针进行荧光RT-PCR检测。同时对细胞感染出现的阳性分离株提取病毒RNA，反转录为cDNA后，参照文献[5]中使用的JEV特异性引物进行PCR检测，对得到的阳性PCR样品进行回收，送梓熙生物公司进行序列测定。

1.4系统进化分析使用Clustal X2.09软件完成序列比对，Bioedit进行序列编辑，MegAlign软件完成病毒核苷酸和氨基酸同源性分析，使用Mega 5.0 软件绘制JEV系统发生树(Neighbor-Joining方法)，Bootstrap值设定为1 000。绘制系统发生树所选用的其他病毒株包含JEV的五种基因型别，外群基因MVE-1-51为墨累山谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus, MVEV)(表1)。

2　结果

2.1蚊虫标本采集2016年8月30日至9月7日，在山东省微山县、莒南县、垦利县共采集蚊虫标本8 418只，其中三带喙库蚊(Culextritaeniorhy-nchus)共3 535只占41.99%，中华按蚊(Anophelessinensis)共1 883只占22.37%，骚扰阿蚊(Armigeresobturbans)共3 000只占35.64%。

2.2病毒分离蚊虫标本共分为81批进行研磨处理，研磨上清液接种细胞，获得8株能够引起BHK-21细胞规律病变的阳性分离物，编号为SDJN1633、SDJN1635、SDJN1646、SDWS1607、 SDWS1614、SDWS1615、SDWS1617、SDWS1619。

2.3分子生物学检测使用基于JEV E基因特异性引物对8株阳性分离物的cDNA进行序列扩增。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，显示该8株分离物在约1 500 bp有目的核酸片段，测序后比对分析发现该8株阳性分离物均为基因Ⅰ型JEV。81批蚊虫标本中，实时荧光RT-PCR法共检测出23批阳性，阳性率为28.4%。所有阳性标本均是从三带喙库蚊中获得(表2)。

表1　本研究中采用乙脑病毒序列背景信息

注：a：为本次新分离乙型脑炎病毒株b☆：MVE-1-51为进化分析时所用外群

Notes：a：JEV strains isolated in this studyb：MVE-1-51 was used as an outgroup in all phylogenetic analyses

表2　2016年山东省蚊虫标本中乙型脑炎病毒分离及检测

注：a每批指蚊虫研磨时，50-120只/研磨管，一管为一批；“—”：代表没有采集到该蚊种

Note:aMosquitoes were homogenized in 50-120 individuals per pool; “—”: No collection of this mosquito species

2.4新分离JEV系统进化分析对得到的8株新分离JEV进行E基因序列测序，与GenBank中收录的不同型别、不同国家的JEV序列E基因核苷酸序列做系统进化分析。构建基于Neighbor-Joining方法的核苷酸系统进化树。新分离的8株病毒与山东省分离得到的JEV均属于基因Ⅰ型乙脑病毒(KL78/SD/CHN/13、VN11/SD/CHN/13、SD0810、RC34/SD/CHN/13)且同属一个支进化分支(图1)[3-4]。新分离8株乙脑病毒与山东省以往分离的乙脑病毒之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.3%～99.4%和99.6%～100%。

注：黑色三角形代表本研究分离的8株JEV图1　山东省乙脑病毒E基因系统进化分析Note: Black triangles represents the 8 strains of JEV isolated in this studyFig.1　Phylogenetic analysis of JEV isolated from Shandong

3　讨论

JEV又称日本脑炎病毒，因其在日本暴发并首次分离到该病毒而命名。患者感染JEV后，大部分表现为非特异性症状如发热、头痛、咳嗽等，但是一旦病毒侵入神经系统，会引发严重的中枢神经系统损伤甚至死亡，在儿童中神经系统后遗症出现的概率为30%[6]。山东省1986年将乙脑疫苗纳入儿童计划免疫后，乙脑的流行强度逐年下降[7]。但是近年来流行特征发生改变，出现以成人病例为主的乙脑暴发流行[8]。

乙脑传播途径主要以蚊—猪(鸟)—蚊为主，人是终末宿主，环境中的蚊媒密度与乙脑的感染概率关系密切，库蚊属蚊虫是山东省的优势蚊种，其中又以三带喙库蚊为主[9]。本次调查结果也反映出三带喙库蚊在数量上的优势。并且分离的和核酸检测阳性的标本均来自三带喙库蚊，进一步证实三带喙库蚊是携带和传播乙型脑炎病毒最主要的媒介。

JEV主要以乙脑病毒E基因区段作为靶点基因[10]。本研究通过对JEV E基因序列进行进化分析，发现新分离JEV均为基因Ⅰ型，与之前山东省蚊虫中分离的JEV一致[3,11]，说明基因Ⅰ型乙脑病毒是目前山东省流行的主要型别，与我国及亚洲目前流行基因型别一致[12]。此外，进化分析显示山东省新分离JEV均聚集在一起，且与之前在山东省分离到的JEV亲缘关系最近，说明山东省内JEV的遗传进化较为保守，在当地形成稳定的自然循环圈。

利益冲突:无

[1]Campbell GL，Hills SL，Fischer M，et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis[J]. Bull World Health Organ，2011，89(10): 766-774.DOI:10.2471/BLT.10.085233.

[2]林小娟，刘桂芳，张丽，等. 山东省1986～2010年流行性乙型脑炎流行病学特征分析[J]. 现代预防医学, 2013,40(13): 2389-2391.DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.04.002.

[3]高晓艳，王海岩，王环宇，等. 山东省新分离乙脑病毒(SD08-10株)全基因组序列特征[J]. 中华实验和临床病毒学杂志，2009，23(4): 242-244.DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.04.002.

[4]Tao ZX，Liu GF，Wang M，et al. Molecular Epidemiology of Japanese Encephalitis Virus in Mosquitoes during an Outbreak in China，2013[J]. Sci Rep，2015，4. DOI: 10.1038/srep04908.

[5]Wang HY，Takasaki T，Fu SH，et al. Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China[J]. J Gen Virol，2007，88(3): 885-894.DOI: 10.1099/vir.0.82185-0.

[6]Solomon T，Vaughn DW. Pathogenesis and clinical features of Japanese encephalitis and West Nile virus infections[J]. Curr Top Microbiol Immunol，2002，267: 171-194.DOI:10.1007/978-3-642-59403-8.

[7]徐爱强，刘桂芳，宋立志，等. 现阶段山东省乙脑流行因素的探讨[J]. 预防医学文献信息，1996，2(2): 129-130.DOI:10.16406/j.pmt.issn.1672-9153.1996.02.034.

[8]尹遵栋，汤伯明，唐晓燕，等. 以大年龄病例为主的流行性乙型脑炎发病危险因素的病例对照研究[J]. 中国疫苗和免疫，2013，19(3): 235-239.

[9]杨培培，李文娟，程鹏，等. 山东省南水北调沿线蚊类密度及流行性乙型脑炎病毒自然感染状况研究[J]. 中国媒介生物学及控制杂志，2016，27(3): 232-234,240.

[10]Zheng YY，Li MH，Wang HY，et al. Japanese encephalitis and Japanese encephalitis virus in mainland China[J]. Rev Med Virol，2012，22(5): 301-322.DOI: 10.1002/rmv.1710.DOI:1-.1002/rmv.1710.

[11]王海岩，高晓燕，宋立志，等. 山东省首次分离出基因1型流行性乙型脑炎病毒[J]. 中国疫苗和免疫，2009，15(4): 337-340.

[12]Gao XY，Li XL，Li MH，et al. Vaccine strategies for the control and prevention of Japanese encephalitis in Mainland China, 1951-2011[J]. PLoS Negl Trop Dis，2014，8(8): e3015. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003015.DOI:10.1371/journal.pntd.000315.