曹炳　沈志森　林乐希　郝文娟　周重昌

喉癌是呼吸系统常见恶性肿瘤之一，其发病率居呼吸系统恶性肿瘤的第2位，仅次于肺癌[1]；国人发病率有明显上升趋势，且发病年龄趋于年轻化，尤其在北方地区[2]。喉鳞状细胞癌（LSCC）是喉癌最常见的病理类型。喉癌的发生包括遗传学和表观遗传学两大机制，以及吸烟、饮酒过度、病毒感染等因素的参与[3]。目前认为，以抑癌基因启动子异常甲基化（会导致基因沉默或失活）为代表的表观遗传学改变是肿瘤发生的重要机制之一，检测肿瘤相关基因启动子异常甲基化已逐步成为早期筛查肿瘤的常用方法[4-5]。人类CLDN11基因定位于3q26.2，其编码的Claudin-11蛋白是完整的膜蛋白，为组成细胞紧密连接的主要成分，而紧密连接蛋白的异常表达被认为是肿瘤进展的重要一步[6]。CLDN11基因表达下调会增强肿瘤细胞迁移、侵袭能力，进而促进肿瘤发生、发展[7]，如脑膜瘤[8]、胃癌[7]、恶性黑色素瘤[9]、口腔癌[10]、皮肤黑色素瘤[9]等。然而，CLDN11基因启动子甲基化与喉癌的关系报道少见。基于此，本研究探讨CLDN11基因启动子在LSCC组织中的甲基化水平，分析其与LSCC临床病理特征及预后的关系，并评估其对LSCC的诊断价值，现报道如下。

1　对象和方法

1.1对象选取2011年1月至2016年1月在宁波大学附属李惠利医院耳鼻咽喉头颈外科住院治疗的LSCC患者91例，其中男87例，女4例；年龄40～86岁，中位年龄60岁；吸烟者73例。患者术前均未接受放化疗，既往无癌症史。临床分期采用国际抗癌协会（UICC）TNM分期标准（2002），并由2位病理科医师进行组织学确认，其中Ⅰ、Ⅱ期44例，Ⅲ、Ⅳ期47例；高中分化鳞癌78例，低分化鳞癌13例；有淋巴结转移32例，无淋巴结转移59例。手术切取LSCC组织及距癌组织边缘0.5cm以上的癌旁正常组织立即放入液氮中，并转入-80℃冰箱冷冻保存。本研究获得医院医学伦理委员会批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2DNA提取和亚硫酸氢盐修饰根据制造商的说明书，使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen,Hilden,Germany）从LSCC组织及癌旁正常组织标本中提取基因组DNA。使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific Co.Ltd.,Wilmington，USA）评估DNA质量和数量，样品在260/280nm吸光度比值为1.8～2.0，则认为提取的DNA纯度较满意。根据制造商的说明书（Zymo Research,Orange,CA,USA），使用具有ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit的Methylamp DNA修饰试剂盒将洗脱的DNA进行亚硫酸氢盐修饰。

1.3CLDN11基因启动子甲基化水平测定采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应（qMSP）法。根据仪器指南，使用LightCycler 480（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）扩增亚硫酸氢盐修饰的DNA。qMSP所需引物：CLDN11-正义5′-ATAAGTTGATAGGAGAATCGAATCG-3′，CLDN11-反义5′-AACGAAAATAACCCTAAACACGTA-3′。内参为β-actin基因（ACTB），ACTB-正义5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′，ACTB-反义5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′。PCR反应体系为20μl，包括双蒸水（ddH2O）6μl，模板DNA 2μl，PCR Buffer 10μl，上下游引物各1μl。反应条件为：95℃预变性10min，95℃20s，60℃30s，72℃30s，共50个循环。采用亚硫酸氢盐转化通用甲基化人类DNA标准（ZYMO研究公司）作为阳性对照。为了纠正样品质量和数量之间的差异，ACTB被用作内部控制。qMSP通过甲基化指数（PMR）进行指标量化。PMR代表基因甲基化阳性的模板DNA在其中所占的比例，实验中分别将每个样本的甲基化Ct值，阳参和内参的Ct值代入以下公式计算得出：PMR=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct样本-Ct内参）-（Ct阳参-Ct内参）。

1.4观察指标（1）比较LSCC组织与癌旁正常组织CLDN11基因启动子甲基化水平。（2）分析LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平与临床病理特征的关系[11]，包括性别、年龄、有无吸烟、癌组织学类型、临床分期、T分期、有无淋巴结转移。（3）评估CLDN11基因启动子甲基化水平对LSCC的诊断价值。（4）以甲基化水平0.571为临界值，将患者分为高甲基化组（30例）和低甲基化组（61例）[12]。随访至2017年8月，分析LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平与患者预后的关系。1.5统计学处理应用SPSS18.0统计软件；计量资料以表示，LSCC组织与癌旁正常组织CLDN11基因启动子甲基化水平比较采用配对t检验，不同临床病理特征的LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平比较采用两独立样本t检验；绘制ROC曲线评估CLDN11基因启动子甲基化水平对LSCC的诊断价值，得出AUC、灵敏度、特异度；采用Kaplan-Meier法估计高甲基化组与低甲基化组患者的生存率并绘制生存曲线，两组患者生存率的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1LSCC组织与癌旁正常组织CLDN11基因甲基化水平比较见图1。

由图1可见，LSCC组织CLDN11基因甲基化水平明显高于癌旁正常组织[（0.256±0.219）vs（0.060±0.090）,P＜0.01]。

2.2LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平与临床病理特征的关系见表1。

由表1可见，LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平与患者性别、年龄、有无吸烟、癌组织学类型均无关（均P＞0.05），Ⅲ、Ⅳ期、T3～4期、有淋巴结转移的LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平分别高于Ⅰ、Ⅱ期、T1～2期、无淋巴结转移的LSCC组织（均P＜0.01）。

2.3CLDN11基因启动子甲基化水平对LSCC的诊断价值见图2。

由图2可见，AUC为0.884（95%CI：0.835～0.932,P＜0.01），甲基化水平为0.571时，诊断LSCC的灵敏度、特异度分别为0.923、0.736。

图1　LSCC组织与癌旁正常组织CLDN11基因甲基化水平比较

表1　LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平与临床病理特征的关系

图2　CLDN11基因启动子甲基化水平诊断LSCC的ROC曲线（箭头示PMR最佳截断点）

2.4LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平与患者预后的关系见图3。

图3　LSCC组织CLDN11基因启动子高甲基化组与低甲基化组患者生存曲线比较

由图3可见，与低甲基化组患者相比，高甲基化组患者总生存率较低（P＜0.01）。

3　讨论

CLDN11基因编码的Claudin-11蛋白属于Claudins家族成员之一，Claudins蛋白的表达下降可能会降低细胞黏附，促进肿瘤发生[13]，已在小鼠皮肤肿瘤的发生、发展过程中得到证实[14]。本研究分析CLDN11基因与LSCC的关系。LSCC患者早期往往无特异性临床症状，特别是声门上癌。LSCC患者常通过CT、MRI和内镜病理组织活检来进行诊断。然而，CT和MRI对LSCC诊断的灵敏度和特异度不是很理想，很少有LSCC患者通过CT或MRI可明确诊断。内镜病理组织活检仍然是诊断LSCC的金标准，然而这种方法由于其侵入性而受到限制，并且不适用于大规模筛查。因此，迫切需要进一步研究LSCC的发生机制，并寻找潜在的LSCC生物标志物来提高早期诊断率。

抑癌基因启动子异常甲基化可能是肿瘤发生的早期事件。近年来，大量研究表明CLDN11基因启动子异常甲基化在肿瘤发生、进展和转移过程中起重要作用。Agarwal等[7]发现与其对应的癌旁正常组织相比，胃癌组织中CLDN11基因启动子甲基化水平明显升高，而CLDN11基因表达明显下调，从而通过增加肿瘤细胞的运动和侵袭性促进胃癌的形成。Walesch等[9]报道与皮肤正常上皮和发育异常痣相比，恶性黑色素瘤的CLDN11基因启动子甲基化水平显著升高。此外，Abe等[10]认为CLDN11基因启动子异常甲基化与高危口腔白斑有关。本研究结果发现，与癌旁正常组织相比，LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平明显增高。这提示CLDN11基因启动子甲基化是LSCC常见的特异性事件，并且有可能作为LSCC早期诊断的生物标志物。

肿瘤的临床分期与有无淋巴结转移是头颈部鳞状细胞癌重要的预后指标，极大地影响患者的生存率及治疗方案的选择[15]。本研究发现CLDN11基因启动子甲基化水平在淋巴结转移、临床Ⅲ、Ⅳ期和T3～4分期患者中明显升高，表明CLDN11基因启动子甲基化可能在疾病进展和转移中发挥关键作用。

对于头颈部肿瘤，目前已经评估了几种生物标志物，以改善诊断和随访，包括癌胚抗原（CEA）、组织多肽抗原（TPA-M）、鳞状细胞癌抗原（SCCA）和细胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）。Eleftheriadou等[16]报道，CEA、TPA-M、SCCA和CYFRA 21-1在LSCC诊断中的灵敏度为0.165～0.468。本研究结果显示，CLDN11基因启动子甲基化水平为0.571时，诊断LSCC的灵敏度、特异度分别为0.923、0.736。这表明CLDN11基因启动子甲基化对LSCC有较高的诊断价值。

抑癌基因启动子高甲基化与肿瘤的的低生存率有关[17]，Meng等[18]发现CLDN11基因的表达水平与乳腺癌患者的生存率密切相关。本研究结果显示，与CLDN11基因启动子低甲基化组患者相比，高甲基化组患者总生存率较低。这表明异常甲基化的CLDN11基因可能是预测LSCC患者预后的生物标志物。

不可否认，本研究尚有不足之处。首先，本研究只包含91例样本，需要更大样本、多中心研究进一步验证结果；其次，本研究未检测CLDN11基因的蛋白表达水平，今后的研究可考虑。

综上所述，LSCC组织中CLDN11基因启动子呈高甲基化水平，且在Ⅲ、Ⅳ期、T3～4期及有淋巴结转移患者中明显增高。此外，CLDN11基因启动子高甲基化LSCC患者的总生存率低。CLDN11基因启动子高甲基化或可作为LSCC诊断和预测预后的生物标志物。

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