陈薇薇

摘 要 分子标记技术是一种遗传标记技术，其具有特别的优越性，在生物学领域中被广泛应用，对各种动植物的长效发展具有重要的推动作用。基于此，将分子标记技术及其在果树种质资源上的应用作为研究对象，通过对分子标记技术的概述，进而对其在果蔬种质资源上的应用展开分析，以期为果树种植奠定良好的基础。

关键词 分子标记技术;果树种质资源;应用分析

中图分类号：Q75 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.36.070

近年来，分子标记技术发展迅速，人们对于生物遗传规律的认知也日渐加深。从1975年开始，人们开始通过DNA分子技术对生物进化、分类以及基因、遗传建立等方面展开研究，直到1985年有学者提出了PCR技术，其实现了复杂DNA片段的体外扩增，凭借着迅速、准确以及高度灵敏等优势受到生物界的重视，在品种鉴定、系谱分析、遗传图谱建立等领域广泛使用。

1 分子标记技术类型

分子标记的类型较多，其按照分子生物学技术主要分成3种。1）在杂交技术基础上提出的分子标记，其中代表性最强的就是RFLP技术。2）在PCR技术基础上提出的分子标记技术，其主要分为RAPD、AFLP、SCAR等技术。3）在重复序列基础上提出的分子标记技术，其中具有代表性的就是SSR、ISSR等技术。

2 分子标记技术在果树种质资源上的应用

2.1 品种鉴定分类

果树基本为多年木生植物、无性繁殖，不同地区栽培技术互相借鉴，使得更多物种产生，类型增多，如葡萄品种超过20 000种，但是实际计算发现其只有5 000～8 000种，果树品种鉴定分类混乱成为当前果树种质资源开发的一个重点问题。传统的果树品种鉴定分类主要是利用植物特征比较和细胞学、酶学等方面进行，但其无法准确区别材料关系相近的果树。随着科技的发展，分子标记技术的提出和应用使得果树品种鉴定分类更加准确，其通过DNA多态性为我国果树品种的鉴定分类起到了重要的推动作用。

自从RAPD技术在果树品种鉴定中应用之后，其已成功地对苹果、桃杏、草莓、柿子等多种果树进行了具体的鉴定。例如，苹果通过RAPD技术对“Fuji”品种的实木苗植株与芽变进行了区分，并没有检测检测到两者存在遗传变异可能性。而在对杨梅等属性的植物进行RAPD鉴定时，将中美区域不同品种的杨梅实现了具体区分，但是其在对杨梅品种进行分类时发现与RAPD结果不同，这需要进一步的完善杨梅分类方法[1]。在对地中海区域中的油橄榄进行分析之后发现17种油橄榄种质资源具有明显的多态性，经聚类分析，17个品种分成大小两类果群，其与形态学的分类是相同的[2]。

2.2 建立遗传图谱

建立遗传图谱是当前遗传学研究领域的一种重要方向，其是对基因组展开系统研究和遗传育种的重要依据，对于果蔬早期育种选择具有重要的作用。传统遗传图谱的建立是在形态、生理以及生化标记的基础上建立起来的，由于其工作复杂，大部分的作物遗传图谱的建立不够快。随着分子标记技术的发展和应用，人们在建立果树遗传图谱上也更加便捷，当前人们已经利用分子标记遗传技术对苹果、樱桃、葡萄等果树建立了遗传图谱。

Weeden等[3]利用RAPD和RFLP与同工酶分析建立了苹果遗传图谱，苹果品种图谱标记构成共有253个，属于24个连锁群。King[4]建立了欧洲地区的苹果遗传图谱，其标记了苹果生长、果实性状、抗寒抗病程度等基因性质。DIRLE等[5]將桃F2分离群体作为试验材料，按照524个引物中所具备的38个多态引物扩增了8个连锁群体。Cai[6]对柑橘杂交群体实行了RAPD分析，并与同工酶等方法共同建立了9个连锁群体，将80%的基因组覆盖完成。

遗传图谱的建立耗时时间长、投资多，彼此合作能够推动深入研究，澳洲与欧洲共同建立的苹果基因计划，其通过建立与苹果抗白粉、黑星、蚜虫等病症和果实品种、矮化等情况相关的遗传图谱。同时，英法等国家也建立了核果类基因计划，通过RFLP、RAPD以及形态等位点建立了多个遗传图谱，标记了油桃、抗蚜虫等病症基因。

2.3 分析遗传多样性

遗传多样性是生命系统基本特征，其是物种自然进化发展的基础。而分子标记技术作为种质资源遗传多样性检测的工具，其在果树种质资源检测上的研究分为两方面：1）筛选核心种质，也就是通过最小群体使最全面的遗传信息保存下来;2）群体遗传变异，是从分子方面对群体遗传的多样性展开了研究，通过RAPD技术分析了宽皮柑橘品种之间在高度遗传上存在的多样性，得到对其品种变化具有决定作用的就是有性杂交以及性状重组这两个因素。

Warburton ML等[7]利用RAPD技术对136个品种的桃子进行了遗传多样性分析，得到美国品种遗传情况单一，亚洲品种遗传多样。张开春等[8]通过38个随机引物对平邑甜茶展开了RAPD研究，得到了其中稳定的DNA条带超过了170条，其中两条为多态性谱带，这就表示无融合生殖平邑甜茶的遗传特征高度相同，遗传分化表现较小。而Vicente等[9]通过RFLP技术以扁桃DNA为基础对欧美品种的遗传多样性进行了分析，分析得到西班牙的品种遗传多样性不明显。沈向[10]在对杏品种进行分析之后得到品种之间尽管存在地域差异，但是彼此之间的遗传信息联系十分密切，具有遗传一致性表现。

2.4 标记基因

标记基因主要是将与目的基因联系密切的筛选出来，其是基因克隆与分子育种的基础。分子标记能够使样品DNA分子中的多样差异被迅速找出来，进而将其与差异区的标记出来，进而确定目的基因定位区域。现阶段，目的基因标记方法分为连锁图法、近等位基因系法和集群分离分析方法3种。但是，由于大部分的果树在遗传连锁图及其饱和度上缺乏，因此连锁图法的价值不足。近等位基因系方法需要7代以上才能够使用，其使用具有一定的困难性。而集群分离分析方法则是将群体中的个体按照目的性状不同而分成了两组，各组个体DNA等量混合，建立了混合池，之后寻找基因组片段差异，标记连锁型的基因，这是当前果树基因标记的重要方法。

利用BSA方法对油桃和桃的杂交出的后代筛选出和果肉硬度等相关的RAPD标记。利用BSA以及RAPD技术筛选标记，同时将其标记在基因两侧，遗传距离约为2 cm。而在对有毛、无毛以及白肉、黄肉等属性的桃进行RAPD技术分析标记的时候，其连锁距离分别为5 cm和9.5 cm。在分析海棠中找到了与苹果中存在的抗黑星病的基因相关的标记，其中两个标记基因连接的十分紧密，在对其进行克隆测试的时候，合成了特异序列引物，对其品种进行了抗性优化鉴定。研究结果表示，一般的无核果木无核性状是由多基因所控制的，这些其有主效与微效两种分别。将RAPD标记转变成为了SCAR标记，在扩增SCAR引物扩增之后获得的无核基因表达与携带者。

2.5 分析系谱

果木中的天然杂种较多，一些品种是由实生选育得到的，还有一些是由混合花粉杂交选育得到的。在无法判断这类果木亲本的时候，分子标记就能够解决这种问题。苹果品种津轻是在日本金冠基础上得到的优良果木，其父本不清，可能为红玉，在通过分子标记技术分析之后得到其与红玉存在基因重叠现象，进而确认父本是红玉、陆奥等三倍体品种，但是亲本是二倍的，因此其体配子相对不清，之后在对其进行RAPD谱带扩增分析的时候，得到二倍体配置母品种就是金冠，这与同工酶分析方法得到的结果是一样的。温州蜜柑栽培技术最早是在日本，但是栽培技术的起源是在中国，这是由RAPD技术得到的结果，而在对温州蜜柑进行分析的时候发现其RAPD带型和我国浙江的宽皮柑橘相似，但是与日本的立花橘存在较大的差异，这就表明温州蜜柑和我国浙江宽皮柑橘关系更加接近。

3 结论

分子标记技术在果树种质资源中的应用为人们从自然环境中获取更多的资源提供了便利，同时也使得人们对自然资源的利用更加科学合理，其通过鉴定品种、建立遗传图谱等工作为果树育种提供了便利，促使果树育种速度提升，提高了培育效率，解决了果蔬育种周期问题，为果树遗传改良方面也作出了一定的贡献。果木作为木生植物，其生长周期长，自交不亲和，品种差异性较大，这就导致果树遗传群体及其作图群体相对困难，进而对分子标记在果树遗传应用上受到影响，发展不够完善。总体而言，标记多态性低是由于其提供的DNA水平信息无法满足资源研究要求，遗传图谱饱和度不高，标记距离大，分子标记研究和育种实践关系不亲等。对此，我國需要加强国际之间的交流合作，对果树生产中的问题结合起来，进行分子标记重点研究，筛选更多的多态性探针等，进行自动化的标记，进而使果树的遗传改良进程加快，为促进我国果木遗传标记技术的发展奠定基础。

参考文献：

[1] 李好先.分子标记类型及其在石榴种质资源研究中的应用[A].中国园艺学会石榴分会筹备组.中国石榴研究进展（一）[C].中国园艺学会石榴分会筹备组：中国园艺学会，2010.

[2] 林伯年，徐林娟，贾春蕾.RAPD技术在杨梅属植物分类研究中的应用[J].园艺学报，1999，26（4）：221-226.

[3] Weedn NF， Hammat M， Lawson DM， et al. Development and application of molecular marker linkage maps in woody fruit Crops[J]. Euphytica， 1994，（77）：71-75.

[4] King G Y. Progress in mapping agronomic genes in apple （the european apple genome mapping project） [J]. Euphytica，1994，（77）：65-67.

[5] Dirle wanger E， Bodo C. Molecular genetic mapping of peach[J]. Euphytica， 1994，77（12）：101-103.

[6] Cai Q. Exiention of the linkage map in citrus using RAPD markers and RFLPmapping of cold-acclimation-resposive loci[J]. Theor Apple Genet，1994， 89（5）：606-614.

[7] Warburton ML， Bliss F A. Genetic diversity in peach （Prunus persica L. Batch） revealed by randomly amplified polymor-phic DNA （RAPD） markers and compared to onbreeding confficients[J]. J. Amer.Soc.Hort.Sci.， 1996，121（6）：1012-1019.

[8] 张开春，吴禄平，李荣旗，等.RAPD技术检测平邑甜茶遗传一致性的有效方法[J].农业生物技术学报，1997，5（2）：201-202.

[9] Vicente MC， Truco MJ， Egea J， et al. RFLP variability in apricot （Pruns armeniaca L.）[J].Plant breeding，1998（117）：153-158.

[10] 沈向.用RAPD再探核果类果树间亲缘关系[J].西北农业大学学报，1999，27（4）：19-22.

（责任编辑：赵中正）