梁敏华，杨震峰，苏新国，*，宋春波

(1.广东食品药品职业学院 食品学院，广东 广州 510520； 2.浙江万里学院 生物与环境学院，浙江 宁波 315100； 3.华南农业大学 园艺学院，广东 广州 510640)

桃(PrunuspersicaL.)是我国重要跃变型果实之一，原产于我国，栽培历史悠久，全国范围内现存品种800余个，实际用于栽培食用品种30个左右[1]。果实呼吸跃变是一个复杂的生理生化过程，可生成众多与色泽外观、风味、营养品质密切相关的活性物质，如类胡萝卜素、醛酮类物质、可溶性糖、酚类物质等[2-3]。营养物质的积累以及外观色泽的持续改善是果实采后成熟衰老的重要标志，类胡萝卜素的持续合成与积累是果实成熟衰老过程中呈色的一个重要因素[4-5]。

桃果实中类胡萝卜素的组成及含量会因果实种类、发育过程和采后贮藏环境的差异而有所不同[6-8]。其合成过程遵循类异戊二烯途径进行，涉及许多酶促反应，其中八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)是该合成途径中的一个关键限速酶[9]。2分子C20化合物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)在PSY的催化作用下生成合成途径中的第一个类胡萝卜素八氢番茄红素[10]。研究发现，GGPP同时也是维生素、赤霉素、叶绿素等代谢产物的前体物质，因而，PSY又是调控植物中碳源流向的关键基因之一[11]。近年来，越来越多研究采用基因工程相关技术，结果发现，诱导PSY基因的特异性表达可以显著增加植物非绿色组织中的类胡萝卜素含量[12-14]。本实验以桃果实为材料，采用RACE技术从桃果实中克隆了PSY基因，通过实时荧光定量PCR分析其在不同品种、不同果实发育组织的表达情况，以期为阐明其所编码的酶蛋白在桃果实类胡萝卜素生物合成与积累过程的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

实验材料分别选取浙江奉化金丽(PrumuspersicaL. Batsch cv. Jinli，黄肉)和湖景(PrumuspersicaL. Batsch cv. Hujing，白肉)两个品种的花苞、花、叶芽、软核果(盛花后35～45 d)、硬核果(盛花后55～65 d)。所有样品不能有机械损伤及病虫害，并于1 h内运回实验室进行下一步处理。

1.1.2 主要试剂

不同品种桃果实的发育组织总RNA提取均采用Omega公司的R6827型试剂盒并依照其说明书进行操作。第一链cDNA的合成和普通PCR聚合酶采用康为世纪的PCR Amplification Kit(CWBIO)和2×EsTaqMasterMix。RACE克隆反应采用TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA扩增试剂盒。PCR实时荧光定量分析采用Thermo公司的DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA提取与cDNA合成

桃果实不同发育组织总RNA的提取采用Omega公司的植物RNA专用提取试剂盒，无RNase活性DNaseⅠ用于去除总RNA中残留的微量DNA。以总RNA为模板，康为世纪公司的cDNA合成试剂盒用于合成桃果实发育组织的反转录第一链cDNA。

1.2.2 PSY基因序列克隆与生物信息学分析

根据植物学分类原理，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜索与桃果实同源性较高的植物PSY氨基酸序列，通过氨基酸序列比对分析，查找氨基酸保守区域，利用在线软件(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)在相邻氨基酸保守区域分别设计上下游简并引物(表1)。以反转录第一链cDNA为模板，加入上下游简并引物和普通PCR聚合酶进行PCR扩增反应，PCR程序如下：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33个循环；72 ℃延伸2 min。PCR产物经纯化、转化、测序得到桃果实中PSY基因的核苷酸序列片段。以上述PSY核苷酸序列为模板，分别设计PSY基因5′-RACE和3′-RACE特异引物(表1)，采用RACE试剂盒进行嵌套式PCR反应，PCR产物经纯化、转化、测序得到PSY基因5′和3′末端核苷酸序列片段。

采用DNAMAN5.2.2软件对以上测序得到的核苷酸序列片段进行拼接得到PSY全长cDNA序列。ExPASy在线软件用于确定PSY基因开放阅读框(http://web.expasy.org/translate)及预测氨基酸、蛋白质性质等(http://web.expasy.org/protparam)。NCBI及GeneDoc2.7.0软件用于分析比对PSY蛋白氨基酸序列。在线软件Predictprotein(https://www.predictprotein.org)用于预测PSY蛋白的亚细胞定位及二级结构。基于同源建模原理，使用SWISS-MODEL服务器(http://swissmodel.expasy.org)进行PSY蛋白三级结构的预测及展示。采用MEGA5.1软件进行PSY基因系统进化树分析。

表1本试验所用引物

Table1Primers used in this study

基因名称Genename引物序列∗(5′⁃3′)Primersequence用途PurposePpPSYForward：GGGCTATTTGGGCTATTTAYGTNTGGTGReverse：TCCCGGTTCAGCTCAGTAACNCCYTTYTC中间片段扩增Intermediatefragmentamplification3′⁃GSP1：ATTTCCCGTTGACATTCAGCCATTCAAAGATA3′⁃GSP2：TACTGCTATTATGTTGCTGGGACTGTTGGATT3′⁃RACEPCR扩增3′⁃RACEPCRamplification5′⁃GSP1：TCCAACAGTCCCAGCAACATAATAGCAGTAGAG5′⁃GSP2：CATATCTTTGAATGGCTGAATGTCAACGGGAAA5′⁃RACEPCR扩增5′⁃RACEPCRamplificationForward：TATTATGTTGCTGGGACTGReverse：GTGTTTGTGAGCTGATTCG实时荧光定量PCRRealtimefluorescencequantitativePCRPpTEF2Forward：GGTGTGACGATGAAGAGTGATGReverse：TGAAGGAGAGGGAAGGTGAAAG内参Internalreference

* H = A/T/C；R = A/G；Y = C/T；N = A/T/C/G。

1.2.3 实时荧光定量PCR

根据PSY基因全长核苷酸序列在其编码区内设计实时荧光定量PCR引物(表1)。以反转录第一链cDNA为模板，采用Mx3000P 实时荧光定量PCR仪(Agilent)进行三步法扩增分析。反应总体系为25 μL，其中包含cDNA 1 μL、上下游引物(100 μmol·L-1)各1 μL、SYBR Green PCR混合液(Thermo Scientific)13 μL、DEPC水9 μL。PCR程序如下：95 ℃预变性7 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，40个循环；72 ℃延伸15 s。以PpTEF2作为内参基因[15]，每个反应进行3次生物学重复，并设置阴性对照。最终结果分析采用2-ΔΔCT法。实验数据采用OriginPro9.0软件进行分析并作图，结果表示为平均值±标准偏差。实验结果采用Duncan氏新复极差法进行显著性分析(P≤0.05)。

2 结果与分析

2.1 PSY基因的克隆与生物学分析

2.1.1 基因克隆与凝胶分析

以反转录第一链cDNA为模板，采用RT-PCR技术反应得到桃果实中PSY基因的核苷酸序列片段，长度为639 bp(图1)。以上述核苷酸片段为模板分别设计5′RACE和3′RACE特异引物，通过RACE扩增技术获得桃果实中PSY基因5′和3′端核苷酸序列片段(图1)。准确拼接上述序列片段获得桃果实PSY基因全长核苷酸序列。BLAST比对显示，克隆获得的PSY基因核苷酸全长序列与其他植物的PSY具较高同源性，因此将它命名为PpPSY。

2.1.2 氨基酸序列同源性比对与系统进化树分析

ExPASy在线软件分析显示，PpPSY基因具有完整的开放阅读框，长度为627 bp，编码208个氨基酸，其中酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)与碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)比例为6∶7，编码蛋白分子量23.6 ku，等电点9.04，呈弱碱性，不稳定，亲水指数-0.361，水溶性较好(图2)。

M， 100 bp DNA Marker；1， RT-PCR产物；2， 3′RACE产物；3， 5′RACE产物M， 100 bp DNA Marker; 1， The product of RT-PCR; 2， The product of 3′RACE; 3， The product of 5′RACE图1 桃果实PSY基因cDNA PCR扩增Fig.1 Amplification for the cloning of PSY gene cDNA from peach fruits

a， 蛋白功能结构域预测；b， 氨基酸序列同源性比较a， Protein functional domains prediction; b， Homology comparison of putative amino acids’ sequence图2 PpPSY蛋白功能结构域预测及氨基酸多重序列比对Fig.2 PpPSY protein functional domains prediction and multiple alignment of the putative amino acids’ sequence

参照从其他物种上获得9条与桃果实PpPSY同源性较近的PSY编码的氨基酸序列，序列比对结果及功能结构域分析显示(图2)，第59～83位氨基酸属于八氢番茄红素合成酶特异识别域，第1～173位氨基酸属于Trans_IPPS_HH保守结构域，包含底物结合位点、Mg2+结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域，其属于isoprenoid biosynthesis enzymes Class 1超级家族。进化树分析显示(图3)，PpPSY与同属蔷薇目的梅果实PmPSY(gi|133251410)聚类于一个分支内，亲缘性好，可信度高。

图3 PpPSY基因系统发生树Fig.3 Phylogenetic trees of PpPSY gene

2.1.3 酶蛋白亚细胞定位与二、三级结构分析

通过Predictprotein在线软件进行亚细胞定位及二级构件预测分析，结果表明，PpPSY蛋白定位在叶绿体上，二级构件中α-螺旋元件占60.58%，无规则卷曲元件占38.94%，β-折叠元件占0.48%，其中α-螺旋元件与无规则卷曲元件占主要比例，这与使用SWISS-MODEL服务器预测得到的蛋白质三级结构结果基本吻合(图4)。

2.2 PSY基因在桃果实不同发育组织中的表达分析

以桃果实反转录第一链cDNA为母液进行等梯度稀释，并以稀释液为模板，加入PpPSY特异荧光定量PCR引物进行反应，以检测PCR扩增效率及扩增产物特异性。结果表明，PCR扩增反应效果良好，扩增效率为90.9%，扩增产物熔解曲线在温度为80.0 ℃时出现溶解单峰，产物特异性强。PpPSY基因在金丽和湖景果实发育组织中的表达情况因品种不同而有差异，以白肉品种湖景的花苞的表达量作为初始值并设定为1，实验结果表明(图5)，PpPSY在黄肉品种金丽花苞、花、叶芽、软核果、硬核果中的表达均高于白肉品种湖景，且在花苞、花、硬核果中的表达显著高于湖景品种(P≤0.05)。在金丽品种中，PpPSY在花苞和硬核果中的表达无显著性差异(P>0.05)，但两者均显著高于花、叶芽和软核果(P≤0.05)；PpPSY在花中的表达显著高于叶芽和软核果(P≤0.05)，但后两者相互之间无显著性差异(P>0.05)。在‘湖景’品种中，PpPSY在花苞、花、叶芽、软核果和硬核果中的表达无显著性差异(P>0.05)。

图4 PpPSY蛋白的三级结构预测Fig.4 The deduced tertiary structure of PpPSY protein

相同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在0.05水平上差异不显著。The same letter means non-significant difference at 0.05 levels by Duncan’s multi-test.图5 PpPSY基因在桃果实不同发育组织中的相对表达量Fig.5 Relative expression of PpPSY gene in different developmental tissues of peach fruit

3 讨论

近年来，对拟南芥种子[16]、薯块茎[17]、玉米胚乳[18]、龙胆花瓣[19]、番茄果实[20]等的研究表明，PSY是类胡萝卜素进行生物合成过程的重要限速酶。Shumskaya等[21]研究发现，植物体内相关等位基因可自发形成功能突变体，后者通过特定催化位点突变而使得PSY蛋白具有特异酶催化活性。本研究采用基因克隆技术获得桃果实PpPSY基因全长cDNA序列，生物信息学分析结果显示PpPSY蛋白二级构件中主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，水溶性较好。李卿等[22]研究发现，蛋白质折叠结构的形成能使得蛋白质形成良好的亲水表面以及疏水内核，这与本研究结果基本相符。功能分析显示，PpPSY基因编码的氨基酸序列上存在底物结合位点、Mg2+结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等结构域，这与麦秀英等[23-24]的研究结果完全一致，这些结构域共同形成了PSY特定酶催化功能。上述研究结果可望为后期深入研究提供研究思路和切入点。

PSY作为植物类胡萝卜素生物合成途径中的第一个限速酶，近年来越来越受研究学者的重视。研究发现，杏果实和柑橘果实中的PSY基因表达与类胡萝卜素积累具有良好的正相关性[25-26]。PSY基因的正向表达诱导了枸杞花中类胡萝卜素的生物合成积累并产生黄绿色花[27]。Paine等[28]通过基因工程技术，采用玉米PSY取代“黄金水稻”PSY，结果发现，“黄金水稻”中总类胡萝卜素含量较之前增加了约23倍。通过调控木薯、番茄等植物PSY基因超量表达，结果发现，木薯根部、番茄果实中类胡萝卜素各组分含量均有不同程度的增加[20，29]。由此可见，PSY基因是诱导植物类胡萝卜素生物合成的主效基因之一。本研究通过对桃果实不同发育组织中PSY基因表达情况进行分析，结果显示，在黄肉品种金丽中，PpPSY在花苞和硬核果中的表达较高，显著高于在花、叶芽和软核果中的表达；而在白肉品种湖景中，PpPSY在花苞、花、叶芽、软核果和硬核果中的表达较低且相互之间均无显著性差异。以上研究结果表明，PpPSY在金丽品种果实发育组织中的表达活性强于湖景品种。

PpPSY基因的成功克隆及生物信息学分析结果可为后续PpPSY蛋白功能鉴定、结构分析等实验研究提供一定的理论依据。PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景，且在金丽品种中，PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达，数据分析结果可为后续进一步探明桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理提供数据参考。

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