刘雪芹，游小燕，吴 梦，丁玉春，刘作华*，葛良鹏*

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.农业部养猪科学重点实验室，重庆 402460；3.养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆 402460）

猪体细胞克隆技术已经应用于商业以及胚胎研究，其过程包括猪卵母细胞的体外成熟培养、卵母细胞核移植、重构胚融合、胚胎体外发育与胚胎移植，最后得到遗传上与核供体细胞一致的后代。猪的体细胞克隆实验全年都可以开展，但一年四季气候不同，大气温度也不相同，而猪的卵母细胞和胚胎对温度变化非常敏感[1]，因此选择合适的季节进行实验将有利于提高猪体细胞克隆效率。重庆素有“火炉”之称，夏季高温炎热，且夏季是重庆全年最长的季节，达120～140 d[2]。张坤等[3]研究表明，季节变化影响体外成熟卵母细胞的发育能力，对胚胎移植的妊娠率和出生率都有影响。目前尚未出现关于重庆地区季节变化对体细胞克隆猪生产效率的影响的报道。本文统计了本实验室2014—2016年不同季节的猪卵巢获卵数、猪卵母细胞体外成熟率以及体细胞克隆代孕母猪妊娠率、产仔率，研究重庆地区不同月份对猪体细胞克隆的影响，找到适合开展猪体细胞克隆实验的月份，为提高猪体细胞克隆效率奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 实验设计 由于本实验室在12—2月开展实验较少，故实验数据不包括这几个月。实验在重庆市荣昌县进行，夏季是重庆全年最长的季节，参考《重庆统计年鉴2016》将月份大致划分为3—5月（春季）、6—9月（夏季）、10—11月（秋季）。实验一比较3—5月、6—9月、10—11月猪卵母细胞的回收率以及体外培养猪卵母细胞成熟率（排出第一极体卵母细胞比率），实验二比较在3—5月、6—9月、10—11月进行胚胎移植手术对代孕母猪妊娠率和产仔率的影响。

1.2 实验材料 如无特殊注明，实验试剂均购自Sigma公司，实验所用卵巢采自重庆市荣昌县屠宰场。各种溶液配制参照《piPSC克隆猪研究》[4]。

洗卵液（PVA-TL -Hepes）：6.663 g NaCl，0.237 g KCl，0.168 g NaHCO3，0.041 g NaH2PO4，1.868 mL C3H5NaO3，0.102 g MgCl2·6H2O，2.383 g Hepes，0.065 g Penicillin G，0.010 g Phenol Red，0.294 g CaCl2·2H2O，0.100 g PVA，2.186 g Sorbitolum，0.025 g Gentamicin，0.022 g Sodium Pyruvate上述溶解于Mini-Q H2O中，调pH为7.2～7.4后用Mini-Q H2O定容至l 000 mL，0.22 μm滤器过滤分装，放于4℃保存，3周内用完。

成熟培养基：9.5 g/L TCM-199，1 g/L PVA，2.2 g/L NaHCO3，0.549 6 g/L D-Glucose，0.000 1 g/mL Sodium Pyruvate，0.075 g/L Penicillin G，0.05 g/L Streptomycin，0.07 g/L L-cysteine，0.5 μg/mL LH，0.5 μg/mL FSH，10 ng/mL EGF上述成分用胚胎用水定容，用0.22 μm滤器过滤分装，放于4℃保存。

猪卵泡液（PFF）的获取：抽取3～6 mm卵泡中的液体到50 mL离心管中等卵沉到底部后抽取上层液体，1 000 r/min离心20 min后用0.45 μm滤膜过滤，-20℃冻存备用。

去卵丘液：0.1 g Hyaluronidase，6 g Mannitol，0.001 g BSA，5 mL PVA-TL-Hepes，加胚胎用水溶解，溶解后用HCl调节pH到7.0～7.4，定容至100 mL，用0.22 μm滤膜过滤，-20℃冻存。

操作液：0.95 g TCM-199，0.005 g NaHCO3，0.075 g Hepes，500 μL100×Penicillin G+ Streptomycin，0.175 5 g NaCl，0.3 g BSA加胚胎用水溶解定容至100 mL，用0.22 μm滤器过滤，放于4℃保存，2周内用完。

融 合 液：2.73 g Mannitol，0.015 g CaCl2·2H2O，0.002 g MgCl2·6H2O，0.013 g Hepes加胚胎用水溶解定容至100 mL，用0.22 μm滤器过滤，放于4℃保存，2周内用完。

猪胚胎培养基础液（PZM-3）：0.6312 g NaCl，0.210 6 g NaHCO3，0.074 6 g KCl，0.004 8 g KH2PO4，0.009 8 g MgSO4·7H2O，0.061 6 g Ca-lactate·5H2O，0.002 2 g Sodium pyruvate，0.014 6 g L-glutamine，0.054 6 g Hypotaurine，2 mLBME，1 mL MEM，1 mL 100×Penicillin G+ Streptomycin，1%BSA 加胚胎用水溶解定容至100 mL，用0.22 μm滤器过滤分装，放于4℃保存，2周内用完。

1.3 实验方法 实验方法参照《piPSC克隆猪研究》[4]。

1.3.1 卵母细胞体外成熟 用装有含青链霉素的38.5℃生理盐水的保温瓶在屠宰场取卵巢，运回实验室。用20 mL的注射器扎破卵巢表面卵泡，同时抽出卵泡内的液体（带有卵母细胞复合物）。在体式显微镜下，用口吸管分别挑选卵丘包裹3层以上、致密而且胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体（COCs），用成熟培养液洗涤3遍再转入在培养箱中至少己经平衡4 h的培养液内（每个培养孔500 μL培养液，放50～80个）。在38.5℃，5%CO2的培养箱中培养42～46 h。在成熟培养终止后，将COCs转移到含1 mg/mL透明质酸酶脱卵丘液中，用100 μL移液器吹打2～5 min脱去卵丘细胞。在体视镜下挑选卵黄膜完整、卵周隙清楚、排出第一极体的视为成熟卵母细胞。

1.3.2 体细胞核移植显微操作 采用盲吸法。在培养皿皿盖中，用含CB浓度为7.5 ng/μL的操作液做几个操作滴，中央1个滴放供核细胞，四周几个滴放猪成熟卵母细胞，然后用矿物油覆盖。将注射针（内径18～25 μm）和固定针（内径 10～20 μm，外径 100～120 μm）装上显微操作臂，并调整好位置，调整好的注射针和固定针在一条直线上。固定针固定卵母细胞，注射针拨动卵母细胞找到第一极体并吸取第一极体及其周围10%～20%可能含有卵母细胞核的胞质。挑选直径15～20 μm、边缘光滑且折光性强的体细胞，并将其注入到卵周隙，点压透明带使供核细胞与受体卵的胞膜紧密接触。操作完成后的卵母细胞是由供核细胞卵胞质构成的重构卵，将重构卵转移到操作液中恢复。

1.3.3 重构胚的融合与培养 将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡20 s，洗涤3遍后，每批30个放入己经铺满融合液的融合槽内（电极宽度为500 μm，德国 eppendorf），使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，用融合仪进行融合激活，参数为30 μs，55 V，2次脉冲，再用PZM-3洗涤5遍，立即转入操作液中30 min后取出，在体视显微镜下判定是否融合。将融合胚胎在PZM-3中洗3遍后，转入石蜡油覆盖并预先在CO2培养箱中平衡至少2 h的PZM-3培养12～24 h。

1.3.4 胚胎移植及产仔率统计 以发情后2 d左右的太湖猪作为代孕母猪，将培养了12～24 h的重构胚胎通过输卵管伞部进入输卵管进行胚胎移植。手术后的母猪单独圈养，定期观察以防伤口感染。观察母猪返情情况，40 d后用全数字便携式超声诊断系统检测妊娠情况，114 d左右根据产仔情况统计产仔率。

1.4 统计分析 实验所得数据采用SPSS 13.0统计软件中的t检验和方差分析，数据结果以平均值±变异系数表示。以P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 不同月份对猪卵巢回收卵母细胞数的影响 由表1所示，3—5月平均每个卵巢回收可用卵数显著高于6—9月和 10—11月（P＜0.05），而6—9月和10—11月差异不显著（P＞0.05）。

表1 不同月份对猪卵巢回收卵母细胞数的影响

2.2 不同月份对猪卵母细胞体外成熟的影响 由表 2可见，3—5月的卵母细胞体外成熟率显著高于其他2组（P＜0.05），而6—9月和10—11月差异不显著（P＞0.05）。

表2 不同月份对猪卵母细胞体外成熟的影响

2.3 不同月份对体细胞克隆代孕母猪妊娠率和产仔率的影响 由表3可见，3—5月进行移植手术的代孕母猪的妊娠率（64.71%）高于6—9月（53.33%）和10—11月（53.33%）。3—5月的产仔率（52.94%）高于6—9月（20%）和10—11月（40%），6—9月进行胚胎移植的代孕母猪的产仔率最低。

3 讨 论

虽然研究者们已经为改善猪体细胞克隆效率做出了很多的努力，但体外培养的猪卵母细胞的发育能力远未达到体内发育水平。影响猪体细胞克隆生产的因素有很多，其中季节导致的温度变化也是重要的因素之一。

本实验中，采集卵巢的生理盐水温度稳定在38.5℃左右，并且在相同的温度条件下培养猪卵母细胞。因此，在本实验中，猪卵巢的回收卵母细胞数以及猪卵母细胞的成熟率的月度差异最有可能是由于大气温度变化所致。在重庆地区的3—11月，其中3—5月猪卵巢获卵数最高，猪卵母细胞的体外成熟率也最高，表明季节是决定猪卵母细胞体外成熟率的主要因素之一；6—9月猪卵巢卵母细胞回收数少，体外成熟率低，可能与热应激有关。Hale等[5]报道，热应激会诱导卵泡期卵巢产生自噬，会增加卵母细胞和早期卵泡中的抗凋亡信号传导。李莉等[6]报道，采集猪卵巢最适宜的月份为5—10月，其他季节采集的猪卵巢卵母细胞体外成熟率与这一季节相比差异显著，与本实验结果不一致，这可能由于所处地区、气候环境各异造成。

表3 不同胚胎移植月份对体细胞克隆代孕母猪产仔率的影响

产仔率是体细胞克隆效率最直观的表现。本实验中6—9月的猪卵巢获卵数以及猪卵母细胞成熟率同10—11月没有区别，但在后续的代孕母猪产仔率上，6—9月移植的代孕母猪其产仔率远远低于3—5月和10—11月。本实验在重庆市荣昌县进行，重庆大部分地区的极端高温在40～43℃，而母猪最佳繁殖性能的温度为18～20℃，22℃以上就会发生热应激。袁焰平等[7]报道，配种月份的平均温度与母猪的平均产仔数、平均产活仔数均存在一定的负相关。在本实验中，6—9月进行胚胎移植的代孕母猪的产仔率最低，说明高温天气对胚胎移植的代孕母猪的产仔率有一定负面影响。

4 结 论

重庆地区不同月份的气候条件对猪的卵巢获卵数、猪卵母细胞成熟率以及代孕母猪产仔率都有影响，即对体细胞克隆猪的生产效率有影响。3—5月猪卵母细胞成熟率以及代孕母猪妊娠率、产仔率都最高，即3—5月体细胞克隆猪的生产效率最高，最适合做体细胞克隆实验，其次为10—11月。

[1] Leibo S P, Martino A, Kobayashi S,et al. Stage-dependent sensitivity of oocytes and embryos to low temperatures[J]. Anim Reprod Sci, 1996, 42(1): 45-53.

[2] 赵路伟. 重庆市高温灾害风险评价研究[D]. 重庆: 西南大学,2016.

[3] 张坤,张运海,潘登科, 等.季节对猪体外成熟卵母细胞的发育能力的影响[J].自然科学进展, 2007(7): 963-967.

[4] 樊娜娜. piPSC克隆猪研究[D]. 合肥: 中国科学技术大学,2012.

[5] Hale B J, Hager C L, Seibert J T,et al. Heat stress induces autophagy in pig ovaries during follicular development[J]. Biol Reprod, 2017, 97(3): 426-437.

[6] 李莉, 华再东, 郭帅, 等. 猪卵巢采集月份、保存温度及时间对其卵母细胞体外成熟的影响[J]. 湖北农业科学, 2013,52(23): 5805-5808.

[7] 袁焰平, 秦春娥, 王振华, 等. 温度对母猪产仔性能影响的分析及适宜配种方案的探讨[J]. 养猪, 2011(5): 25-30.