山鸡主要疫病免疫与抗体消涨规律的研究

2018-03-19卫龙兴袁红艳戴连群张春华方桂明

今日畜牧兽医 2018年6期

卫龙兴，袁红艳，戴连群，张春华，方桂明，焦楠

（1.上海市奉贤区动物疫病预防控制中心 201400；2.上海欣灏珍禽育种有限公司 201403）

前言

山鸡，俗称野鸡、学名雉，是一种在我国广泛分布的小型鸟类，其外貌绚丽多彩、肉质细嫩鲜美、野味浓郁醇厚、营养丰富齐全，具有较高的经济和观赏价值；近年来，随着社会发展和物质生活水平的不断提高，人们对名特优新产品的需求也不断增长，而山鸡作为其中的典型代表，成为了人们的首选，市场需求与日俱增，人工养殖的规模和数量逐年上升；据不完全统计，目前国内存栏商品种山鸡约200万套，年上市商品肉山鸡近亿羽、商品山鸡蛋约5亿枚，成为特种养殖中规模最大的品种。

山鸡的抗病能力较强，野生环境下几乎无疾病发生。但山鸡的规模化人工养殖，在有效缓解市场需求和生态保护压力的同时，高密度人工饲养也加速了山鸡抗病能力的退化，显著增加了各类疫病的发生概率，特别是高致病性禽流感（HPAI）、鸡新城疫（ND）、鸡传染性支气管炎（IB）、H9N2 亚型禽流感（MPAI）、鸡传染性法氏囊（IBD）等主要疫病，已严重危害了产业的发展。而目前国内还没有一套专门用于山鸡的各类主要疫病的免疫程序，也未见系统开展山鸡各类主要疫病免疫及抗体消涨规律研究的报导，养殖户基本都是参照家禽的推荐免疫程序进行免疫，免疫失败现象时有发生。为此，作者根据多年从事山鸡养殖和疾病防控的经验，经过精心设计和组织准备，开展了一轮针对山鸡HPAI等主要疫病的全周期免疫效价评估试验，相关结果如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验山鸡

某大型山鸡养殖场1日龄祖代种山鸡雏苗1万羽，上海欣灏珍禽育种有限公司2016年7月2日出雏；孵化过程严格按照种蛋孵化流程操作。试验山鸡入孵种蛋为43周龄健康种山鸡所产，其在整个饲养期已按照蛋鸡免疫程序分别实施了各类主要疫病的规范免疫。

1.1.2 免疫疫苗

各主要疫病免疫疫苗见表1。

表1 试验山鸡各主要疫病免疫疫苗汇总表

1.1.3 检测试剂

1.1.3.1 HPAI、ND、MPAI等主要疫病HI检测试剂见表2。

表2 试验山鸡HPAI、ND、MPAI等疫病HI检测试剂汇总表

1.1.3.2 IB、IBD等主要疫病ELISA检测试剂见表3。

表3 试验山鸡IB、IBD等ELISA检测试剂汇总表

1.2 方法

1.2.1 试验山鸡饲养

试验山鸡饲养阶段与饲养方式见表4。

表4 试验山鸡各饲养阶段及方式汇总表

1.2.2 试验山鸡免疫

对试验山鸡全周期（56 周）实施 HPAI、ND、IB、MPAI和 IBD等主要疫病免疫，免疫程序详见表5。

1.2.3 采样与样品处理

采样批次、日龄和样品数量见表6。

样品处理与保存

整个试验期共采集试验山鸡14个批次、280份血液样品和43周龄亲本母山鸡1个批次、20份血液样品，总数为15个批次、300份血液样品。

表5 试验山鸡主要疫病免疫程序表

表6 饲养山鸡各阶段采样数量汇总表

每个批次样品在采集后立即分离血清，标记后冷冻保存；至全部15个批次血样全部采集完成后集中检测。

1.2.4 检测与判定

各主要疫病抗体检测方法与评定标准见表7。

表7 试验山鸡各主要疫病抗体检测方法与评定标准汇总表

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 亲本母山鸡20份血样各主要疫病免疫抗体检测结果

2.1.1.1 HPAI、ND、MPAI等主要疫病HI抗体检测结果见表8。

表8 HPAI、ND、MPAI等三种疫病HI抗体检测结果汇总表

2.1.1.2 IB、IBD等主要疫病ELISA抗体检测结果见表9。

表9 IB、IBD等二种疫病ELISA抗体检测结果汇总表

2.1.2 试验山鸡14个批次样品各主要疫病抗体检测结果

2.1.2.1 H5N1 HPAI抗体检测结果

①各批次样品HI检测H5N1 HPAI抗体均值与合格率见表10。

表10 各批次样品HI检测H5N1 HPAI抗体均值与合格率汇总表

②各批次样品HI检测抗体均值变化情况见图1。

③各批次样品HI检测抗体阳性合格变化情况见图2。

2.1.2.2 ND抗体检测结果

①各批次样品HI检测ND抗体均值见表11。

②各批次样品HI检测ND抗体均值变化情况见图3。

③各批次样品HI检测ND抗体阳性合格变化情况见图4。

图1 各批次样品HI检测HPAI抗体均值折线图

图2 各批次样品HI检测抗体阳性合格率折线图

表11 HI检测ND抗体均值和阳性合格率汇总表

图3 各批次样品HI检测ND抗体均值变化情况折线图

图4 14个批次样品HI检测ND抗体阳性合格率折线图

2.1.2.3 IB抗体检测结果

①各批次样品ELISA检测IB抗体OD均值及阳性合格率见表12。

②各批次样品ELISA检测IB抗体OD均值变动情况见图5。

③各批次样品ELISA检测IB抗体阳性合格率变动情况见图6。

2.1.2.4 H9N2 MPAI抗体检测结果

①H9N2 MPAI抗体HI检测均值与阳性合格率见表13。

②H9N2 MPAI抗体HI均值变动情况见图7。

③H9N2 MPAI抗体合格率变动情况见图8。

表12 各批次样品ELISA检测IB抗体OD均值及阳性合格率汇总表

图5 各批次样品ELISA检测IB抗体OD均值折线图

图6 各批次样品ELISA检测IB抗体阳性合格率折线图

表13 14个批次样品H9N2 MPAI HI抗体HI均值与阳性合格率汇总表

图7 14个批次样品H9N2 MPAI抗体HI检测均值折线图

2.1.2.5 IBD抗体检测结果

①各批次样品ELIS检测IBD抗体OD均值与阳性合格结果见表14。

②各批次样品ELISA检测IBD抗体OD均值变动情况见图9。

③各批次样品ELISA检测IBD抗体合格率变动情况见图10。

2.2 分析

2.2.1 种母山鸡免疫抗体分析

2.2.1.1 HPAI免疫抗体

分析表8可见，43周龄种母山鸡的20份血样中，Re-6株的抗体阳性率达到了100%，且HI平均值达6.85 1og2，远高于4 1og2的合格标准；Re-8株的抗体阳性率为95%，虽然有1份样品的HI值为0，但群体HI平均值仍达到4.7 1og2，超过了4 1og2的合格标准。

图8 14个批次样品HI检测H9N2 MPAI抗体阳性合格率折线图

表14 ELISA检测IBD抗体OD均值与阳性合格结果汇总表

图9 各批次样品ELISA检测IBD抗体OD均值变动曲线图

图10 各批次样品ELISA检测IBD抗体阳性合格率变化曲线

结论：种母山鸡H5N1 HPAI免疫抗体尚可。

2.2.1.2 ND免疫抗体

从表8可以看到，20份样品全部合格，且HI均值达到8.6 1og2的高水平。

结论：亲本母山鸡在留取种蛋时的ND免疫抗体良好。

2.2.1.3 IB免疫抗体

分析表9可以看到，亲本母山鸡在留用种蛋时，其IB的免疫抗体达到了较高的水平，20份样品的OD均值达到了0.497，超过0.0923的临界值达0.4047。

结论：种山鸡IB免疫抗体良好。

2.2.1.4 H9N2 MPAI免疫抗体

分析表8：种母山鸡20份血样的HI值全部合格，平均值达9.0 1og2。

结论：种母山鸡的H9N2 MPAI免疫抗体水平较高，可有效抵御野毒侵袭。

2.2.1.5 IBD免疫抗体

从表9可以看到，亲本母山鸡IBD免疫抗体总体良好，基本呈正态分布，唯一一份不合格样品的OD值也与临界值较接近，大部分样品OD值界于临界值与全部样品均值之间，另有3份样品的OD值超过了检测试验标阳OD值。

结论：种山鸡IBD免疫抗体良好。

2.2.2 试验山鸡抗体检测结果分析

2.2.2.1 H5N1 HPAI抗体检测结果

①母源抗体

分析表10和图1、图2发现，由于种母山鸡的免疫抗体水平较高，初生（0日龄）雏鸡均获得了较高的母源抗体，Re-6株和Re-8株的抗体阳性率分别达到100%和95%，与种母山鸡的抗体合格率相当，而且HI平均值也与种母山鸡的HI平均值较接近。但雏山鸡母源抗体的消失速度较快，10日龄后Re-6株和Re-8株的母源抗体HI平均值均低于4 1og2的合格标准，而且群体的阳性合格率也低于了70%的群体合格标准，说明此时的试验鸡群已处于高危时期，应予免疫。

由于山鸡的个体较小，目前养殖户采用的传统免疫程序均为33日龄左右首免；因此从表10中可以看到，30日龄时Re-6株的母源抗体几乎为0，图1中可直观见到Re-6株 30日龄的抗体HI值已下降至0；而Re-8株则在10日龄达到低谷后，在20日龄和30日龄2个批次的样品检测中，抗体HI值呈现了一个逐步上升的现象，但此时试验鸡群未曾开展相关免疫、亦未见任何异常，这一现象有待作进一步探讨。

②免疫抗体

从表10中还可看到，试验山鸡群33日龄实施首免后，Re-6株的免疫抗体HI值快速上升至8.9 1og2，在强化免疫后持续上升至9.3 1og2，达到第一个高峰值，群体阳性合格率达到100%，但这一较高的HI均值仅维持一个月左右即呈现快速下降，2个月后（180日龄）的HI值已跌至1.75 1og2的低值，且群体合格率也仅为30%，明显低于70%的合格标准。

Re-8株的表现则有所不同，其在首免后的免疫抗体快速上升，并在60日龄时也达到了第一个高峰值，且HI均值达到了10.35 1og2，远高于Re-6株的8.9 1og2，群体阳性合格率也先于Re-6株达到100%。以后Re-8株的抗体水平逐渐稳步下降，即使是69日龄加强免疫也未见抗体HI值有明显的变化，但HI均值下降的速度较慢，4个月后（180日龄）仍保持在合格标准以上（HI均值为 4.95 1og2）。

开产前进行第二次加强免疫后，Re-6株和Re-8株的HI均值分别达到了11.45和11.6的高峰值（实验室检测的最高值为12 1og2），随后免疫抗体稳定且缓慢下降，直至淘汰仍保持较高水平。

③小结

雏山鸡Re-6和Re-8两毒株的母源抗体水平较高，但消退较快。

33日龄首免后，两毒株抗体均快速上升；二免后Re-6株抗体有一个小幅的提升，但Re-8株则对二免无明显反应。三免后，两毒株的抗体水平呈现了稳定的同步上升和消退趋势，且持续保持较高抗体水平，直至淘汰。

2.2.2.2 ND抗体检测结果分析

①母源抗体

从表11和图3、图4中可以发现，雏山鸡ND母源抗体水平较高、但消退速度较快，至20日龄时的HI均值仅为4.2 1og2，已低于了5 1og2的合格标准；而且阳性合格率也降低至50%，低于70%的群体合格标准。从图1中可以更直观地看到母源抗体HI均值有一个平稳且较快速消退的阴性曲线；图2中的阳性合格率曲线也印证了这一现象。

提示：ND母源抗体水平较高、但消退速度较快，应在10日龄左右对雏山鸡进行一次ND有效免疫。

②免疫抗体

结合试验山鸡免疫程序，分析表11和图3、图4可见，试验山鸡在9日龄和12日龄时采用喷雾和滴鼻的方式分别进行了新支H120二联弱毒疫苗的免疫后，该阶段的ND抗体HI均值仍呈现稳定下降现象，未见抗体反弹上升的趋势，说明这2次免疫未对试验山鸡产生免疫作用。

33日龄肌肉注射新支流三联灭活疫苗产生了较强的免疫反应，试验鸡群ND免疫抗体的HI均值快速上升至9.95 1og2的高水平，且样品阳性合格率达到100%；69日龄采用新支流三联灭活疫苗加强免疫后，HI均值在8.35 1og2以上的高位持续了4个多月的时间，且均衡稳定，样品阳性合格率也持续保持100%；194日龄加强免疫新支流三联灭活疫苗后，210日龄检测的免疫抗体HI均值在原高位又上升了2.5个滴度，达到了10.85 1og2的高水平，并在240日龄时进一步提高至本次试验的最高峰11 1og2。

后期在240日龄时对试验山鸡采用新支H52二联弱毒疫苗进行了一次饮水免疫，但表11的HI均值在此阶段呈现稳定下降趋势，说明这次饮水免疫未产生较强的免疫作用。但在330日龄试验山鸡即将淘汰时，在未采取任何免疫措施的情况下，免疫抗体HI均值有一个较强的反弹，图1的曲线可更直观地看到这一反弹现象；但记录显示此时鸡群未见异常，提示此期试验山鸡可能遭到了ND野毒侵袭，由于鸡群免疫抗体水平较高而使鸡群得到了有效保护。

提示：三次灭活疫苗肌肉注射免疫均起到了较好的作用；但后期弱毒疫苗免疫效果不理想。

2.2.2.3 IB抗体检测结果分析

①母源抗体

从表12可以看到，0日龄雏山鸡的母源抗体OD均值仅为0.098，且样品合格率仅为40%，提示雏山鸡未能较好地继承亲本母山鸡的母源抗体，而且母源抗体随着日龄增长而快速消退，至20日龄时，母源抗体已基本消失殆尽。

提示：试验山鸡在早期未能得到IB母源抗体的保护，应给予有效免疫。

②免疫抗体

试验山鸡按原免疫程序于9日龄和12日龄时分别采用喷雾和滴鼻的方式进行了2次新支H120二联弱毒疫苗的免疫，但从表12和图5、图6可以看到，二次免疫后的OD均值均未见明显的提高。

25日龄注射新支流三联灭活疫苗后，IB抗体开始回升，但速度较慢；49日龄第二次注射新支流三联灭活疫苗后，抗体持续缓慢回升，90日龄和120日龄的OD均值分别为0.228和0.243，但在150日龄时的OD均值有一个突然快速上扬的过程，且1.035的OD均值成为了本次试验的最高值，比前次测定0.243的OD均值上涨了4倍多，而此阶段未进行过任何免疫，故疑似试验鸡群受到IB野毒侵袭，但记录显示鸡群无异常表现，说明鸡群的免疫抗体有效抵御了本次野毒的侵袭。以后几个批次样品的OD均值缓慢下降，但仍维持在0.335以上的较高水平，而同期样品的群体阳性合格率也持续维持在95%以上较高水平。

240日龄采用新支H52二联弱毒疫苗饮水免疫后，270日龄的OD均值上升了0.156，达到了0.491的高值，这一结果与亲本母山鸡的抗体水平基本相符。

提示：IB弱毒疫苗早期喷雾、滴鼻免疫作用较小、效果较差；灭活疫苗的注射可起到较好的免疫作用；后期采用中等毒力疫苗饮水免疫可有效提升群体免疫抗体水平。

2.2.2.4 H9N2 MPAI抗体检测结果分析

①母源抗体

分析表 13和图 7、图 8可以看到：0日龄样品的H9N2 MPAI抗体检测HI均值高达8.45 1og2，且在随后的 10、20、30日龄等三批样品的母源抗体也一直维持在6 1og2以上的较高抗体水平。

提示：H9N2 MPAI的母源抗体良好，且维持时间较长。

②免疫抗体

表13和图7显示：33日龄采用H9亚型灭活疫苗首免后，抗体快速提升至12 1og2，并随着69日龄和125日龄的二次加强免疫，试验山鸡的抗体水平持续升高，并在150日龄时达到14.25 1og2的高峰值，且维持时间较长，在240日龄时的抗体HI均值仍达到10.25 1og2。

在270日龄时，试验山鸡的免疫抗体有一个异常反弹，HI均值高达13.55 1og2，比上一批次样品的HI均值提高了3.3个数量级，而此期试验山鸡未开展任何相关免疫，也未见任何异常。

提示：试验山鸡可能受到H9N2 MPAI的野毒侵袭，但由于群体免疫抗体的高水平有效保护试验山鸡免受损害。

③抗体阳性合格率

分析表13发现，在本次试验山鸡14个批次280份样品的H9N2 MPAI抗体HI检测结果中，仅有3份样品的抗体水平为阴性，其他均为阳性合格样品，阳性合格率达到了98.8%。其中3份不合格样品均在育雏期，分别是10日龄批次2份、30日龄批次1份，这是母源抗体消退后的正常现象。

在33日龄首免后，所有样品均达到阳性合格标准，且抗体水平远超5 1og2的临界值。从图8我们也可以看到，在10日龄和30日龄有两个较小的低谷值外，整个试验期其他批次的抗体阳性合格率均为100%的高峰值。

提示：试验山鸡较好地获得了亲本的母源抗体且维持时间较长；灭活疫苗的免疫效果良好。

2.2.2.5 IBD抗体检测结果分析

①母源抗体

分析表14和图9、图10可以发现，0日龄20份样品的OD均值为0.06，阳性合格率仅为15%。

提示：IBD母源抗体的遗传性较差，亲本母山鸡较高的母源抗体未能较好地传给子代。

②免疫抗体

在全部14个批次280份样品的检测结果中，120日龄前7个批次样品的OD均值均为0.06左右，而OD临界值在0.08左右，抗体水平较低；期间虽经IBD中等毒力弱毒疫苗于19日龄和26日龄二次饮水免疫，但IBD免疫抗体未获提高。

125日龄采用IBD灭活疫苗肌注免疫后，免疫抗体OD均值快速上升，150日龄批次样品检测结果达到0.136，180日龄批次继续上升至0.185，但抗体上升期较短，在210日龄时又快速下降至0.122，240日龄时的OD均值已消退到0.095，接近OD临界值。最后3个批次样品的OD均值又出现了一轮强劲反弹，但期间未进行任何相关的免疫措施，提示试验鸡群在此阶段可能感染了IBD病毒。

提示：IBD弱毒疫苗饮水免疫的效果较差；灭活疫苗肌注免疫有较好的免疫作用，但抗体有效维持期仅四个月左右。

③抗体阳性合格情况

分析表14和图10可见，试验鸡群IBD免疫抗体阳性合格率有2个明显的变化区间，一个是在120日龄以前的低水平区间，另一个是在150日龄后的高水平区间，而125日龄的免疫是两个区间的拐点。

在低水平区间7个批次样品中，阳性合格率最高的仅为25%，最低为0。虽然二次饮水免疫也未见效，抗体检测OD均值无明显提高；在高水平区间，又可分为两个高峰阶段，第一个高峰段是125日龄免疫后，抗体快速上升并维持3个月后的消退阶段，此阶段抗体阳性合格率最高值达到了80%；第二个高峰段是本次试验的最后三个批次样品，在灭活疫苗抗体逐步消退至临界值后，可能是受到IBD野毒感染，试验鸡群的抗体阳性合格率出现了一波强势反弹，高峰值达到了90%，这一变动现象与IBD抗体OD均值的变动情况相符。

3 讨论

3.1 关于HPAI

3.1.1 试验证明：试验山鸡虽从种蛋中获得了较高的母源抗体，但维持时间较短，10日龄时其残留母源抗体已不能有效保护鸡群，建议在10日龄之前实施首免。

3.1.2 重组禽流感H5N1双价灭活疫苗（Re-6株+Re-8株）对山鸡有较好的免疫作用，两毒株均表现了良好的免疫反应。

3.1.3 种母山鸡二免后的免疫抗体达到较高水平，但维持时间不足90天；经过三次强制免疫后，较高的免疫抗体可有效保护鸡群5个月以上，直至淘汰。建议在150日龄左右实施第三次免疫。

3.2 关于ND+IB

3.2.1 试验结果证明：在亲本母山鸡获得较好免疫的基础上，ND母源抗体可较好地遗传给子代，且维持时间较长；而IB母源抗体的遗传性较差，且母源抗体的消退速度也较快。

3.2.2 育雏期采用喷雾、滴鼻等方式免疫新支H120二联疫苗的效果较差；三联灭活疫苗的免疫作用较明显，特别是ND抗体，可快速将HI均值提高至最高峰，而IB抗体虽然上升较慢，但二次免疫后即可达到较高水平，而且抗体消退也较慢；后期采用新支（H52）二联弱毒疫苗饮水免疫，对提高IB免疫抗体有较好的作用。