杨晓龙，韩海玉，王富平

（1.西藏山南市畜牧兽医总站 856000；2.西藏昌都市畜牧总站 854000；3.西藏山南市畜牧兽医总站 856000）

大肠埃希菌对婴儿和幼畜(禽)，常引起严重腹泻和败血症，要从根本上预防和治疗由大肠埃希菌引起的此类疾病，制备免疫保护力高的疫苗被当前医学界认为是最有效的途径之一。本实验以仔猪源致病性大肠埃希菌为材料，采用培养后大肠埃希菌制成菌液与氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂和黄芪多糖佐剂分别制备免疫原。免疫家兔测其抗体效价，以期筛选出优良佐剂，为地区仔猪大肠埃希菌病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：大肠埃希菌O144（编号为2-1-2），分离自青海省互助县某猪场。

养基及试剂：营养肉汤，营养琼脂，黄芪多糖注射液，维生素E软胶囊，三氯化铝。

试验动物 ：非免疫健康兔，体重为2～3kg。

实验仪器：磁力搅拌器、微型振荡器、高压锅、恒温箱、离心机、4℃冰箱等。

1.2 方法

制备菌悬液：将大肠埃希菌O144（2-1-2）接种于普通营养琼脂，37℃培养24h后用灭菌生理盐水洗下，制备浓度达到20亿/m1的菌悬液，最后加入终浓度为0.4%的甲醛溶液，充分混合后置于37℃灭活48h。

无菌检验：将灭活的菌悬液接种于营养肉汤，37℃培养48h，经检验无菌生长者为合格。

制备疫苗：根据文献制备氢氧化铝佐剂苗[1]；根据文献资料相关方法制备矿物油佐剂苗[2]。

检验疫苗安全性：将制备好的疫苗分别皮下注射3只家兔，1m1/kg·体重，观察7d，记录试验家兔精神、运动和食欲等生理活动是否正常。

免疫接种将15只兔分成5组后编号。1组注射氢氧化铝佐剂疫苗；2组先肌肉注射1m1/kg·体重黄芪多糖，再用灭活菌悬液免疫；3组先投喂150～300IU/kg·体重维生素E，再用灭活菌悬液免疫试验动物；4组注射矿物油佐剂苗；5组注射不含佐剂疫苗。每只兔均皮下注射1m1/kg·体重，多点注射，以便使疫苗较快的吸收。共免疫两次，第一次注射后经14d再注射一次，两次注射剂量相同。

血清效价测定

第二次免疫后14d，无菌采血分离血清检测效价。

2 结果

无菌试验结果成立；试验动物接种疫苗后初期精神怠倦，后好转，其后7d内精神、运动和食欲等生理活动未见异常表现，表明注射的疫苗安全性良好。血清效价测定结果详见表1。

表1 血清效价测定结果表

3 讨论

研究显示同一种抗原与不同佐剂结合，均能产生一定的免疫结果，其中采用新型的免疫佐剂均获得较高的抗体效价，维生素E佐剂所产生的抗体效价达到1：1024，黄芪多糖佐剂达到1：512，而临床常用的氢氧化铝佐剂效价只达到1：64，不加佐剂疫苗的抗体效价只有1：32。说明了新型免疫佐剂苗的效果比传统免疫佐剂苗的效果好很多。此实验结果可为今后研制免疫强度高效，毒性小，生产程序简单，低成本，易于推广的新型佐剂提供相关依据。

研制和开发新的免疫佐剂时应严格控制质量标准；利用天然材料制备佐剂时应从具有免疫活性的材料中广泛筛选，进一步保证其作为佐剂的可行性；所制备的佐剂化学成分和生物性状应清晰、稳定，易于储存，不发生变性；无短期和长期的毒副作用；且价格低廉，所开发的佐剂与抗原联合使用可以产生较强的免疫反应，且进入体内的佐剂要易于从体内自行降解，以期达到最好的免疫效果。