沙小梅，郝君晖，涂宗财,*，胡姿姿，王振兴，张露，李鑫，王辉，黄涛

1(江西师范大学 功能有机小分子教育部重点实验室&生命科学学院，江西 南昌，330022) 2(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047)

我国淡水鱼资源丰富，是世界淡水鱼生产大国，淡水鱼养殖量居于世界第一。据统计，2015年我国淡水鱼养殖产量为2 715.01万t，比2014年增加112.04万t，增长4.30%[1]。除鲜销外，淡水鱼主要用于加工，形成各式各样的鱼类加工制品。鱼骨是鱼类加工业的副产物之一，含有脂肪、蛋白、钙、磷等多种营养成分[2]，鱼骨中富含钙质，且钙、磷比例合理，易于被人体吸收[3]，将其添加食品中，可以增加食品的营养价值[4]。但鱼骨十分坚硬，如果将其直接加入食品，不仅会对食品的口感产生一定影响[5]，且其中的营养物质也不能完全被人体吸收利用。目前，对于鱼骨的处理手段逐渐多样化，包括高压脉冲电场法[6]、酶法[7-8]和球磨法[9-10]等。

亚临界水为在100～374 ℃之间、在外加压力的条件下仍然保持液态的水[11]。亚临界水拥有较高的离子积，较低的相对介电常数，黏度和表面张力，从而有利于物质的提取[12]。目前，亚临界水技术较多地用于天然产物的提取[13-15]，同时也在植物精油提取[16]、污泥处理[17]、食品检测[18]和蛋白质改性[19]等多个方面都有应用。亚临界水作为一种特殊的加压压缩流体溶剂，具有环保、无毒及费用低的优点[20]。若能将亚临界水用于鱼骨的软化处理，将有效提高鱼骨的可利用性，增强鱼骨中营养物质的释放程度。

鱼糜是一种现代新型的鱼类加工制品，具有高蛋白、低脂肪、方便快捷等优点[21]。将鱼骨添加至鱼糜中，可进一步提高鱼糜制品的营养价值。因此，本文以醋酸溶液为媒介，采用亚临界水技术的低温段处理鱼骨，以期达到软化鱼骨和保留其营养价值的双重目的。然后将软化后的鱼骨加入鱼糜制成鱼糜凝胶，对比分析软化后鱼骨对鱼糜凝胶性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鲢鱼，市售；其他试剂均为分析纯。

YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BioTek Synergy H1 全功能酶标仪，美国BioTek仪器有限公司；Centrifuge 5430 R 多功能微型台式高速离心机，艾本德(上海)实验室科技有限公司；Easy系列超纯水系统，上海领德仪器有限公司；柯尼卡美能达CR-13色度仪，日本柯尼卡美能达控股公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼骨的处理和成分测定

鲢鱼宰杀后，经过去鳞、去头和去内脏处理，切成2片后再进行采肉机处理即分别得到鱼肉和下脚料，将下脚料中的鱼骨挑选出来，沸水煮1 min后捞出，剔除鱼骨上剩余的鱼肉和膜性组织，用蒸馏水冲洗，放入37 ℃的烘箱中烘12 h，用自封袋封好放入-20 ℃冰箱中备用。参照国家标准对鱼骨中的水分、灰分、粗蛋白、和粗脂肪的含量进行测定。

1.2.2 亚临界水技术结合醋酸软化鱼骨

1.2.2.1 亚临界水温度对鱼骨软化效果的影响

研究亚临界水温度对鱼骨软化效果的影响，分别将亚临界水温度设置为100、108、116、124、132 ℃，处理时间为1 h，醋酸浓度为0.5 mol/L，料液比为1∶20(g∶mL)，结束后测定溶液中钙溶出量和游离氨基含量。

1.2.2.2 亚临界水处理时间对鱼骨软化效果的影响

研究不同亚临界水处理时间对鱼骨软化效果的影响，亚临界水的处理时间分别设置为0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，亚临界水温度为116 ℃，醋酸浓度为0.5 mol/L，料液比为1∶20(g∶mL)，结束后测定溶液中钙溶出量和游离氨基含量。

1.2.2.3 醋酸浓度对鱼骨软化效果的影响

研究醋酸浓度对亚临界水软化鱼骨效果的影响，醋酸浓度分别设为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L，料液比为1∶20(g∶mL)，亚临界水处理温度为116 ℃，处理时间为1 h，结束后测定溶液中钙溶出量和游离氨基含量。

1.2.2.4 料液比对鱼骨软化效果的影响

研究不同料液比对亚临界水软化鱼骨效果的影响，分别以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL)的料液比将鱼骨与水混合，醋酸浓度为0.5 mol/L，亚临界水处理温度为116 ℃，处理时间为1 h，结束后测定溶液中钙溶出量和游离氨基含量。

1.2.3 样品中钙溶出量的测定

用蒸馏水将待测溶液稀释一定倍数，加入3 mL三乙醇胺和5 mL氨性溶液，然后滴入2滴铬黑T指示剂，然后以0.02 mol/L的EDTA标准溶液滴定，酒红色变成蓝色即为终点，根据标准回归方程求解溶液中的钙含量，平行测量3次。标准回归方程是基于以CaCl2为标准物绘制的标准曲线求得。

1.2.4样品中游离氨基含量的测定

采用OPA法测定反应产物中自由氨基的含量。配制OPA试剂，此试剂要现配现用。准确称取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入0.2 g/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)2.5 mL，硼砂(0.1 mol/L) 25.0 mL，β-巯基乙醇100 μL最后用蒸馏水定容到 50 mL。

测定时，取1.0 mL OPA试剂于试管中，加入50 μL样品，混合均匀，放入35 ℃水浴中反应2 min后在340 nm下测吸光值A340，另取1.0 mL OPA试剂于试管中，加入50 μL水作为空白对照。

用相同的方法，以亮氨酸代替样品作出标准曲线，根据曲线计算样品中游离氨基的含量。

1.2.5 鱼糜相关参数测定

1.2.5.1 鱼糜凝胶的制备

将最佳条件下蒸煮的鱼骨打碎，进行旋蒸浓缩。向鱼糜中加入浓缩后的鱼骨和汤汁，调节鱼糜含水量至78%，同时，向另一组鱼糜中加入纯水调节其含水量作为对照组。置于90 ℃的水浴中加热30 min，加热后立即置于冰水中冷却至室温，4 ℃放置12 h，待测。

1.2.5.2 凝胶强度的测定

将制备好的鱼肠从4 ℃取出，室温放置，使鱼肠温度平衡至室温，然后将其切成厚25 mm的片段，破断强度和凹陷度直接采用质构仪测定。采用直径为5 mm的探头，以60 mm/min 的速度穿刺样品至20 mm，穿刺曲线上的第1个峰为破断强度，对应的距离为凹陷度。其中破断强度反映鱼糜凝胶的硬度，凹陷度反映鱼糜凝胶的弹性。二者的乘积为凝胶强度，即：

凝胶强度/(N·mm)=破断强度(N)×凹陷度(mm)

(1)

每组试验重复3次，试验结果为3次测定结果的平均值[22]。

1.2.5.3 白度的测定

参考陈海华等人[23]的方法，将样品切成厚3 mm的薄片，室温下用色差计测定样品的色泽，仪器采用标准白板校正，记录L、a、b表示颜色的坐标，L表示样品的亮度，+a表示样品偏红，-a表示样品偏绿：+b表示样品偏黄，-b表示样品偏蓝。白度W按公式(2)计算：

(2)

每组试验重复3次，试验结果为3次测定结果的平均值。

1.2.5.4 持水性能的测定

参考王雨生等[24]的方法，将样品切成厚3 mm的薄片并称质量(m1)，下面放3张滤纸，上面放2张滤纸，用5 kg的重物压制并保持2 min，去掉滤纸，再将样品称质量(m2)，失水率按公式(3)计算：

(3)

每组试验重复3次，试验结果为3次测定结果的平均值。

1.2.6 数据的统计学分析

所有实验数据都是来源于3个平行样测得的结果取平均值，数据通过SPSS 22.0进行分析，选取Duncan’s test用于显著性分析(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 鱼骨成分组成

鱼骨的成分组成如表1所示。从表1中可以看出，烘干后鲢鱼鱼骨的基本组成成分中，以灰分的含量最高，约为53.85%；其次为蛋白质，约为29.8%；而脂肪和水分含量分别约为8.69%和7.91%。测定结果与马国红等[2]的结果基本相一致。

表1 鱼骨的成分组成 单位：%

2.2 亚临界水技术结合醋酸软化鱼骨的效果分析

2.2.1 亚临界水温度对鱼骨软化效果的影响

亚临界水温度对鱼骨软化后每克鱼骨中钙溶出量和游离氨基含量的影响如图1所示。

图1 亚临界水温度对鱼骨软化中钙溶出量(A)和游离氨基含量(B)的影响Fig.1 The effect of temperature of sub-critical water on calcium content(A)and free amino acid content(B)

图1-A可知，鱼骨软化后钙溶出量随亚临界水温度的升高而逐渐升高，当温度达到116 ℃时趋于平缓。引起此现象的原因可能是当亚临界水的温度升高，在醋酸的作用下，鱼骨中羟基磷灰石分解速度加快，导致溶液中钙离子溶出量增多。当亚临界水温度增加到一定程度(116 ℃)时，鱼骨中的钙溶出量达到最大，所以即使温度进一步升高，鱼骨的钙溶出量也不会再发生变化。

由图1-B可知，鱼骨软化后溶液中游离氨基含量随亚临界水温度的升高而呈现递增的趋势，出现这种现象的原因可能是随着温度的升高，鱼骨中的羟基磷灰石等矿物质逐渐溶出，从而使蛋白质分子摆脱其束缚。在高温和醋酸的共同作用下，蛋白质分子被打断，因此游离氨基含量增加。

综合亚临界水温度对鱼骨软化后钙溶出量和游离氨基含量的影响效果，选取亚临界水温度为124 ℃，此条件下，鱼骨软化后钙和游离氨基的溶出量均比较高，且温度不至于过高而浪费资源和过度水解蛋白质。

2.2.2 亚临界水处理时间对鱼骨软化效果的影响

亚临界水处理时间对鱼骨软化后每克鱼骨中钙溶出量和游离氨基含量的影响如图2所示。

图2 亚临界水处理时间对鱼骨软化中钙溶出量(A)和游离氨基含量(B)的影响Fig.2 The effect of reaction time of sub-critical water on calcium content(A)and free amino acid content(B)

由图2-A可知，鱼骨软化后钙溶出量随亚临界水处理时间的延长而升高，当处理时间达到1.0 h时趋于平缓，说明亚临界水处理时间的增加能够增加鱼骨中的钙离子溶出，且在处理时间达到1.0 h时达到最大。

由图2-B可知，鱼骨软化后溶液中游离氨基的含量随亚临界水温度的升高而逐渐升高，在处理时间达到1.5 h时趋于平稳。这种现象发生的原因可能是随着处理时间的增长，鱼骨中的蛋白质分子不断被打断，从而使游离氨基的含量不断增加。

综合亚临界水处理时间对鱼骨软化后钙溶出量和游离氨基含量的影响效果，选取亚临界水的处理时间为1.5 h。此条件下，鱼骨软化后钙和游离氨基的溶出量均达到最高，鱼骨软化效果好。

2.2.3 醋酸浓度对鱼骨软化效果的影响

醋酸浓度对鱼骨软化后每克鱼骨中钙溶出量和游离氨基含量的影响如图3所示。

图3 醋酸浓度对鱼骨软化中钙溶出量(A)和游离氨基含量(B)的影响Fig.3 The effect of acetic acid concentration of sub-critical water on calcium content(A)and free amino acid content(B)

由图3-A可知，鱼骨软化后钙溶出量随着醋酸浓度的升高而逐渐增加，这是因为随着醋酸浓度的升高，鱼骨中的钙逐渐转化为醋酸钙的量逐渐增多，醋酸钙溶于水中，从而导致钙的溶出量不断增高。

由图3-B可知，鱼骨软化后游离氨基的溶出量随着醋酸浓度的升高而升高，当醋酸浓度达到0.7 mol/L时，游离氨基溶出量趋于平稳。出现这种现象的原因可能是高浓度的醋酸能够促进蛋白质分子被打断从而游离氨基含量增加。在一定条件下，当游离氨基的含量达到一定程度时，即使继续提高醋酸浓度，游离氨基的含量变化也不明显。

综合醋酸浓度对鱼骨软化后钙溶出量和游离氨基含量的影响效果，选取醋酸浓度为0.9 mol/L。此条件下，鱼骨软化后钙和游离氨基的溶出量均达到最高，鱼骨软化效果好。

2.2.4 料液比对鱼骨软化效果的影响

料液比对鱼骨软化后每克鱼骨中钙溶出量和游离氨基含量的影响如图4所示。

图4 料液比对鱼骨软化中钙溶出量(A)和游离氨基含量(B)的影响Fig.4 The effect of solid-liquid ratio of sub-critical water on calcium content(A)and free amino acid content(B)

由图4-A可知，随着料液比的减小，鱼骨软化后钙溶出量逐渐升高。出现这种现象的原因可能是料液比减小，体系中醋酸的量增加，使鱼骨中的钙能够大量转化为醋酸钙，从而增加了鱼骨中钙离子的溶出。

由图4-B可知，随着体系中醋酸量的增多，鱼骨软化后游离氨基的含量随之升高，这是因为醋酸量的增加能够更大幅度地使鱼骨中的钙溶出，从而使鱼骨中的蛋白质分子摆脱束缚，且醋酸量的增加能够加速破坏蛋白质分子，致使游离氨基含量增加。

综合料液比对鱼骨软化后钙溶出量和游离氨基含量的影响效果，以及实际生产中的成本问题，选取料液比为1∶25。此条件下，鱼骨软化后钙离子和游离氨基的溶出量均较高，鱼骨软化效果较好，且醋酸量不至于太大，在实际生产中能够节约成本。

2.3 鱼骨软化最佳工艺的确定

本文以鱼骨软化后钙溶出量和游离氨基含量作为评价指标，研究了亚临界水的温度、处理时间、醋酸浓度和料液比4个单因素对鱼骨软化效果的影响。通过一系列试验指标的测定，结合实验结果和生产过程中的成本问题，最终确定了鱼骨软化的最佳工艺，即亚临界水温度124 ℃，处理时间1.5 h，醋酸浓度为0.9 mol/mL，料液比为1∶25，此时钙溶出量和游离氨基含量最大，如表2所示。

表2 最佳条件下鱼骨软化的相关参数Table 2 The correlation parameter of fish bones treatedwith optimum condition

尹涛[9]分别利用干法球磨和高能湿法球磨的方法对鱼骨进行细化处理，研究了适宜的工艺条件。周亚军等[6]利用高压脉冲电场辅助提取鱼骨中的钙，确定了鱼骨钙提取的最佳工艺。余海霞等[7]利用酶解和超微粉碎技术从鱼骨中制备超微钙粉。上述研究均进行了鱼骨细化的预处理，而本文则以醋酸溶液为媒介，利用亚临界水技术直接对鱼骨进行软化处理，借助醋酸和亚临界水的双重作用使鱼骨中的羟基磷灰石快速形成钙离子溶于溶液中，并使蛋白质的肽键在一定程度上发生断裂，进而提高鱼骨的可利用率，具有高效率、低耗时等优点。

2.4 高钙鱼糜凝胶相关参数

2.4.1 高钙鱼糜凝胶的白度测定

鱼糜凝胶白度的测定结果见表3。

表3 鱼糜凝胶的相关参数Table 3 The whiteness of surimi gel

添加软化后的鱼骨能够影响鱼糜的白度，结果显示，添加软化鱼骨的鱼糜凝胶与对照组鱼糜凝胶相比白度降低，样品偏黄。这是因为在亚临界水处理过程中，鱼骨上残留的膜性组织等会使鱼骨液颜色变黄，将这种软化鱼骨添加进入鱼糜后导致鱼糜凝胶白度降低。

2.4.2 高钙鱼糜凝胶的持水性测定

鱼糜凝胶失水率的测定结果见表3。添加软化鱼骨后的鱼糜凝胶与对照组鱼糜凝胶相比失水率显著降低，持水性能显著提高。说明加入软化后的鱼骨能够使鱼糜形成更加致密、均匀的凝胶网格结构，从而将水分有效地保留在其中，因此失水率降低。

2.4.3 高钙鱼糜的凝胶强度测定

鱼糜凝胶强度的测定结见如表3。添加软化鱼骨后的鱼糜凝胶强度与对照组鱼糜的凝胶强度差别不大，说明加入软化后的鱼骨对于鱼糜的凝胶强度没有太大影响。尹涛[9]的研究结果表明，鱼骨中的钙离子能增强鱼糜中内源性谷氨酰胺转氨酶的活力，形成更多的ε-(γ-谷氨酸)赖氨酸交联而增强鱼糜凝胶的凝胶强度。本文中，鱼骨与鱼糜混匀后立即置于90 ℃的水浴中加热30 min，未进行一段时间的低温凝胶化处理，使得内源性谷氨酰胺转氨酶的交联作用难以发挥，因此鱼骨的添加对鱼糜凝胶强度改变不明显。

3 结论

本文利用亚临界水技术结合醋酸对鱼骨进行软化，根据鱼骨中钙溶出量、游离氨基含量和实际生产成本问题，确定鱼骨软化的最佳条件为：亚临界水温度124 ℃，亚临界水处理时间1.5 h，醋酸浓度0.9 mol/L，料液比1∶25(g∶mL)。此条件下，每克鱼骨的钙溶出量为102.50 mg，游离氨基含量为16.01 mg。将软化后的鱼骨加入鱼糜中，能显著提高鱼糜凝胶的持水性，对鱼糜凝胶强度没有明显改变，但是会降低鱼糜凝胶的白度。

鱼骨软化作为鱼类加工副产物利用的一种方式能够将鱼骨变废为宝，在节约资源的基础上，减少废弃物对环境的污染。经过最佳工艺软化的鱼骨添加进入食品，能够增加食品中易于被人体吸收的钙质，丰富其营养成分，在今后的食品加工行业具有广阔的市场和前景。

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