程杰杰， 殷超凡， 萨尔山别克·热阿合曼， 孙帅欣， 陈云鹏

[上海交通大学农业与生物学院/农业部都市农业(南方)重点实验室，上海 200240]

氮元素作为构成蛋白质和核酸的重要元素，对动植物及微生物都有非常重要的意义。土壤氮素在作物氮素供应上占有重要地位，通过向耕地中增施氮肥来提高作物产量是农业生产上的重要措施[1]。空气中虽然存在大量的氮气，但不能直接被植物吸收利用，只有转化为硝酸盐、亚硝酸盐等化合物后才能被植物吸收。生物固氮即固氮微生物将大气中的氮气还原成氨的过程，是自然界氮循环的主要环节[2]。当前氮肥的主要来源是化工生产，化学氮肥的使用曾为我国农作物的增产作出了突出贡献[3-4]，但同时产生很多环境问题，造成农业点源污染和面源污染[5-7]。

由于氮素化肥的生产伴随着能源的消耗和日趋严重的环境污染等问题，因此生物固氮研究日益受到各国政府的重视。目前发现的具有生物固氮能力的微生物多为细菌，有100多个属，占细胞系统发育分支的1/2以上[8]。不同固氮菌的固氮能力差异比较明显，即使是同种固氮菌在不同的环境条件下或在不同的宿主内也会表现出固氮能力的差异[9]。虽然固氮菌的固氮能力差异较大，但均能在一定程度上促进植物的生长，提高农作物的产量[10]。

本研究测定固氮菌GXGL-4A在LB液体培养基(有氮)、A15液体培养基(无氮)中的生长曲线；以玉米、水稻为试验对象，在其生长过程中施用不同浓度的GXGL-4A，通过测定玉米、水稻的鲜质量、株高、根长、根鲜质量等指标，并进行数理统计分析发现，GXGL-4A对水稻和玉米的生长具有促生作用，且该促生作用在一定范围内随GXGL-4A浓度的增大而增强；对GXGL-4A在玉米根际土壤中的消长动态进行监测，获得其在玉米根际土壤中的消长动态变化情况，可为固氮菌固氮机制的进一步研究及微生物菌肥的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 固氮菌KosakoniaradicincitansGXGL-4A(简称GXGL-4A)分离自广西桂林的玉米根部，为革兰氏阴性菌，有荚膜，能泌铵和胞外多糖类黏性物质，菌体大小约为1.5 μm×0.5 μm。菌体呈杆状，具端生鞭毛。

载体质粒pET28a(+)携带有卡那霉素抗性基因(kanr)标记，由笔者所在实验室余传金惠赠。

1.1.2 种子 玉米种子先玉335(非抗旱品种)和宁玉721(抗旱品种)均购自青上农业科技(吉林)有限公司，水稻种子CBB23由上海交通大学农业与生物学院陈功友教授实验室馈赠。

1.1.3 主要试剂及仪器 2×TaqPCR Master Mix、6×Loading buffer、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒及SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA marker，购自天根生化科技(北京)有限公司；Goldview核酸染料，购自上海少辛生物科技有限公司；卡那霉素(Kan)，购自美国Amresco公司；其他试剂均为国产分析纯。

Leica DM2500荧光显微镜(莱卡微系统公司)；BSW-200B 台式恒温摇床(上海启步生物科技有限公司)；ZDP-2120电热恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；Minispin®离心机、Eppendorf BioPhotometer生物分光光度计(德国Eppendorf公司)；超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 固氮菌GXGL-4A生长曲线测定 以体积分数1%的接种量将固氮菌GXGL-4A接入LB液体培养基(有氮)中，每隔1 h用分光光度计测量1次菌液在600 nm处的吸光度并进行记录。以相同接种量将固氮菌GXGL-4A接入A15液体培养基(无氮)中，8 h后以相同方法测量菌液在600 nm处的吸光度并进行记录，以后每隔3 h进行1次测量。

1.2.2 固氮菌GXGL-4A促生作用研究

1.2.2.1 种子消毒与催芽 将种子在水中浸泡4 h后，用蒸馏水彻底冲洗干净，然后移至75%乙醇中处理2 min，用无菌水清洗2次后，用5% NaClO溶液浸泡5 min，再用无菌水清洗2次。将消毒的玉米和水稻种子用纱布包起来后置于 28 ℃ 恒温培养箱中培养至出芽，出芽标准为胚根与种子等长。

1.2.2.2 固氮菌GXGL-4A的培养 将固氮菌GXGL-4A以1%接种量接种到LB液体培养基中，于37 ℃、160 r/min的条件下振荡培养约4 h(D600 nm约为1.0)，然后在离心机中以8 000 r/min的转速离心10 min，用无菌水洗涤菌体沉淀2次后，再用无菌水将其依次稀释为104、106、108CFU/mL等3个浓度梯度，备用。

1.2.2.3 玉米、水稻种植与接种处理 将发芽的玉米种子植入塑料花盆(内径20 cm、高20 cm)，出苗期每隔24 h于同一时间(12：00)浇水1次，观察记录出苗情况。将大小长势基本一致的玉米、水稻幼苗分别移栽到相同规格的塑料花盆内，设置对照组(CK)和3个浓度梯度(104、106、108CFU/mL)试验组，3次重复。移栽2 d(展出1或2张真叶)后，试验组每隔3 d对幼苗茎基部施加1次固氮菌GXGL-4A(1 mL/株)，对照组加等量无菌水，共计接种7次，培养期间每天12：00浇1次水，以保持土壤湿润。

1.2.2.4 数据采集与分析 接种后30 d，测量每株玉米、水稻的鲜质量、株高、根长、根鲜质量，试验数据通过Excel和SPSS进行分析处理。

1.2.3 根际定殖动态研究

1.2.3.1 固氮菌GXGL-4A卡那霉素抗性标记 将带有pET28a(+)质粒的大肠杆菌以体积分数1%的接种量接入LB液体培养基中，于37 ℃、160 r/min条件下振荡培养约 12 h，然后用试剂盒提取质粒。将提取好的质粒用电击转化法转入固氮菌GXGL-4A中，将转化菌液涂布于LB固体培养基(含50 μg/mL Kan)平板上，置于37 ℃恒温培养箱内过夜培养，然后挑取阳性转化子。

1.2.3.2 土壤处理 采集大田熟土600 g，称取其中的300 g平铺于托盘内，置于120 ℃恒温箱内干热灭菌5 h，待土壤自然冷却后装入无菌袋内备用；剩余土壤不进行灭菌处理，而是直接装入无菌袋内备用。

1.2.3.3 种子消毒与催芽 种子消毒与催芽方法同 “1.2.2.1” 节。种子出芽后，播种于含50 g灭菌土的塑料采样罐(高10 cm，内径6 cm)内，即为封闭系统处理；播种于含50 g非灭菌土的塑料采样罐内，即为开放系统处理。每罐播3粒种子，设3次重复。

1.2.3.4 标记菌GXGL-4A的培养及在玉米根际土壤的释放 待种子破土后，采用灌根法接种固氮菌GXGL-4A。标记菌于含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在 37 ℃、180 r/min条件下培养24 h后，取5 mL用无菌水稀释至 50 mL(接种浓度1×107CFU/mL)，用移液器缓慢地释放至玉米幼苗的根际土壤中。

1.2.3.5 消长动态监测 分别于释放后1、3、6、9、12、15 d取3罐幼苗根际土壤各1 g，加入到9 mL无菌水中涡旋振荡 15 min，即为10-1稀释度，根据含菌量用无菌水进行梯度稀释，取稀释后菌液200 μL涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，并置于37 ℃恒温培养箱内进行过夜培养。统计每个培养皿的菌落数，计算平均1 g根际土壤的含菌量。试验时以释放后1 h回收的细菌数量为初始接种量。

1.2.3.6 数据采集与分析 试验数据通过Excel和SPSS进行分析与处理。

2 结果与分析

2.1 固氮菌GXGL-4A生长曲线分析

由图1、图2可知，固氮菌GXGL-4A在LB液体培养基(富氮)、A15液体培养基(无氮)中均能生长，但生长速度不同。在LB液体培养基(富氮)中生长迅速，接种后约1 h即进入对数生长期，并在测定时间内其D600 nm一直增大；而在A15液体培养基(无氮)中细菌生长缓慢，接种后约10 h才进入对数生长期，约20 h达到生长最大值，之后其D600 nm逐渐减小。据此可知，在营养较丰富的条件下，固氮菌GXGL-4A生长迅猛，而在无氮条件下，固氮菌GXGL-4A虽也能生长，但增殖缓慢，这一结果表明，氮营养水平对固氮菌的生长至关重要。

2.2 固氮菌GXGL-4A促生作用分析

由表1至表3、图3至图9可知，试验组玉米先玉335、宁玉721及水稻CBB23植株的株高、根长、根鲜质量、植株鲜质量等指标与对照组植株整体上差异明显，固氮菌GXGL-4A对水稻CBB23的促生效果较2个供试玉米品种更好。

2.3 固氮菌GXGL-4A根际消长动态分析

从图10可以看出，接种后1～15 d均可以从玉米植株根际土壤中检测到标记菌，在封闭系统与开放系统内，玉米根际土壤的标记菌数量变化趋势基本一致，均先增加后减少，并且均在释放1 d后达到最大值；在相同的接种浓度(1×107CFU/mL)下，封闭系统内标记菌GXGL-4A的数量明显高于开放系统，其原因可能是灭菌土内的微生物数量较少，接种后，固氮菌GXGL-4A迅速占据玉米根际土壤生态位而成为优势种群，而在自然土内微生物群落非常复杂，接种后，固氮菌GXGL-4A与土壤中的原始微生物进行生态位竞争，导致接种后标记菌数量低于灭菌土。

表1 不同处理下玉米品种先玉335的生物量

注：同列数据后不同大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平上差异显著。下表同。

表2 不同处理下玉米品种宁玉721的生物量

表3 不同处理下水稻品种CBB23的生物量

3 讨论与结论

微生物的固氮作用在农业增产中具有十分重要的意义。本研究表明，固氮菌GXGL-4A在营养较丰富的条件下生长迅速，在无氮条件下也可通过自身固氮作用利用空气中的氮气维持自身生长，它对玉米和水稻生长具有显著促生作用，整体上来看，施加固氮菌后的供试植株在株高、根长、根鲜质量及植株鲜质量等方面较对照植株生物量明显提高。在一定浓度范围内，其促生作用随菌液浓度的增加而增强，尤其是根系表现最为明显，固氮菌GXGL-4A能在根际土壤中迅速定殖并成为优势种群，推断其促生作用主要是通过根部定殖来实现的。

先前已有一些关于植物根际促生菌(plantgrowth promoting rhizobacteria，简称PGPR)的研究，主要集中在PGPR菌株的筛选、入侵机制以及促生机制等方面[11-13]，研究结果表明，PGPR可通过固氮、解磷及产生植物生长调节剂等方式来促进植物生长[14-17]。对固氮菌的定殖观测表明，固氮醋酸杆菌能从根尖和侧根发生的周围侵染植物[18]，而固氮螺菌能在根表与皮层之间的周质空间内定殖[19]。虽然固氮菌所固定的氮素供给植物的很少，但细菌死亡后释放的有机氮能逐步被植物吸收利用，此外，固氮菌可以分泌许多有机酸使植物根际pH值下降，使难溶性矿物质变得易溶，从而促进植物根系对各种营养物质的吸收，进而间接促进植物生长[20-21]。

本研究聚焦于固氮菌GXGL-4A的固氮促生作用，在后续研究中，将借助现代分子生物学技术进一步探究其固氮促生机制并对其进行遗传改造，使其具有更强的适应能力和固氮能力，甚至开发成可施性生物肥料，应用前景广阔。

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