栾 剑 曹欢欢 周晓馥

(1. 吉林师范大学生命科学学院植物资源科学与绿色生产吉林省重点实验室，吉林 四平 136000；2. 朝阳市质量检验检测中心，辽宁 朝阳 122000)

1 姜黄素与CFTR

1.1 姜黄素简介

姜黄素[1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione]是从植物姜黄(CurcumalongaL.)的根中提取的。姜黄原产于东南亚，于13世纪被阿拉伯商人引入欧洲，其根部常被用作食物和调味品。马可波罗在1208年访问中国和印度的游记中提到过姜黄，而姜黄在中国传统中药以及印度的阿育吠陀和阿拉伯药物中被用来减轻各种疾病症状已有千年历史[1]。《中国药典》2010版指出，姜黄辛、苦、温。入脾、肝经。破血、行气、通经、止痛。临床常用来治疗血瘀气滞诸痛证、风湿痹痛证、痈疽疔毒证。

自1815年被提取出来[2]，对姜黄素的研究就一直备受瞩目。人体对姜黄素的耐受性很高，最高可达12 g/d，有时伴有轻微腹泻等副作用。姜黄素的口服生物利用度较低[3]，主要表现为一次代谢、胃肠道吸收低、水溶性差、排泄快等[4]。姜黄素具有抑制肿瘤发生[5-6]、抗炎症[7-8]、抗抑郁[9]、预防糖尿病[10]、预防心血管疾病[11-12]和增强神经活性[13]等多重药理作用，有学者称赞其为“The yellow magic”[14]。姜黄素化学结构见图1。

1.2 CFTR及其突变体

囊性纤维化跨膜转运调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一种定位于分泌

图1 姜黄素的化学结构Figure 1 Chemical structure of curcumin

性上皮细胞顶膜的氯离子通道。遗传性致死疾病囊性纤维化，正是由于CFTR基因的突变造成，△F508和 G551D都是常见的突变类型。占突变总数85%以上的△F508是CFTR基因的第508位上苯丙氨酸的缺失造成ER合成的CFTR蛋白错误折叠，并滞留在内质网中，随即被降解，使得整个机体所有的CFTR氯离子通道功能严重不足，导致呼吸衰竭、肠道梗阻、不孕不育等一系列症状，病人平均寿命只有30余年。因此，激活CFTR氯离子通道活性的小分子调节剂，成为治疗囊性纤维化疾病的药物研发的热点。

2 姜黄素对CFTR氯离子通道的激活作用的论证与反驳

2.1 发现

2004年4月耶鲁医学院的Egan在《Science》上发表了原创试验文章[15]，指出给携带纯合△F508-CFTR基因的小鼠喂服姜黄素，使得鼻电位差基线由(-27.9±0.77) mV 降到(-10.8±0.62) mV，该数据几乎与野生型[(-8.36±0.55) mV]等同，而这些效应在敲除了CFTR基因的小鼠中则没有观察到。用姜黄素治疗后，△F508-CFTR突变小鼠对FSK有(4.46±1.0) mV的超极化反应，该数值约为野生型和杂合型小鼠的91%。在37 ℃下用不同浓度的姜黄素处理细胞使得△F508-CFTR蛋白的一部分通过生物合成途径并获得较原来更为复杂的糖基化，以完成蛋白质组装行使功能，且能够诱导△F508-CFTR蛋白向细胞质膜定位。并指出，姜黄素从ER中释放△F508-CFTR的能力与钙网蛋白和△F508-CFTR相互作用的分解有关。此外，姜黄素表现出与异黄酮化合物的结构相似性，异黄酮化合物可以直接结合到CFTR蛋白并改变其通道性质[16]。因此，姜黄素也可能直接与CFTR结合，从而允许其避开ER的监控机制。

文章[17]总结姜黄素治疗可以纠正与纯合△F508-CFTR相关的症状(如图2)。此外，Egan在文[15]中强调其试验使用的口服姜黄素的剂量可与人类良好耐受的剂量相媲美(基于体重换算)，该试验数据小鼠口服给药剂量为45 mg/kg，为期3 d。

2.2 反驳

Egan等[15]的文章引来学界的强烈反响，仅在2004～2005年就有多篇对姜黄素激活CFTR氯离子通道持怀疑态度的针对性科研论文发表。

2004年7月，加州大学圣地亚哥分校的Verkman教授[18]在老牌杂志JBC发表了一篇论文，指出无法支持Egan的论断。Verkman教授是离子通道界的杰出科学家，其在水通道、CFTR氯离子通道等领域的研究始终处于世界领先水平。文章开篇直指Egan使用姜黄素进行研究的理由是姜黄素在0.5×10-5～1.5×10-5μmol/L浓度下作为SERCA的弱抑制剂的作用[18]，这是基于先前研究报告，即同为SERCA抑制剂的Thapsigargin被报道恢复了△F508-CFTR功能[19]。然而，临床研究[20-21]表明，口服姜黄素的生物利用度非常低，肝脏代谢迅速，高剂量给药后血液中仅检测到低纳米摩尔水平，抛出了他对Egan研究结果的疑虑。

图2 姜黄素、钙离子和囊性纤维化[17]Figure 2 Curcumin, Calcium, and Cystic Fibrosis

随后，以重复试验结果的角度出发，再次对姜黄素激活△F508-CFTR的论断提出质疑。首先，在表达△F508-CFTR的FRT细胞中，添加了1.0～4.0×10-6μmol/L的姜黄素在37 ℃预培养24 h的细胞中检验碘离子流入，结果为阴性。其次，以 27 ℃处理组为对照，姜黄素也不能增加初代培养的纯合△F508-CFTR人类呼吸道上皮细胞的短路电流。再次，在纯合△F508-CFTR的突变小鼠中，姜黄素仅能诱导(2.1±0.4) mV超极化。最后，液相色谱/质谱分析表明最大浓度6.0×10-8μmol/L，血清浓度远低于0.5×10-5～1.5×10-5μmol/L。综上所述，无法证明姜黄素在转染细胞、上皮气道细胞和突变小鼠中纠正△F508-CFTR功能性缺陷方面具有显著的作用。此外，所测量的姜黄素的口服生物利用度表明，其最大血清浓度比产生SERCA抑制的建议值低好几个数量级。因此，Verkman课题组的试验结果不支持姜黄素治疗由△F508-CFTR突变引起的囊性纤维化的评估。

随后，同年7月Dragomir等[22]指出，姜黄素在试验中对CFBE和CF鼻上皮细胞的(非CFTR介导的)基底膜氯离子外排有一定的影响，但并没有增加(真正的CFTR氯离子通道介导的)环腺苷酸活化的氯离子外排，而△F508-CFTR 在BHK细胞中出现少量增加。值得指出的是，野生型BHK细胞缺乏CFTR，但是很容易被转染，成为含有非常高水平的野生型或突变型CFTR蛋白的细胞。虽然转染的BHK细胞是研究CFTR功能的模型，但它是高度人工的体系，不能代表真实的气道上皮细胞。试验使用的新分离的鼻上皮细胞则尽可能地接近体内情况，而无需进行实际的临床试验。此外，免疫细胞化学分析结果未能观察到△F508-CFTR向细胞质膜显著的转移。结果表明，姜黄素不太可能在气道上皮细胞也就是囊性纤维化患者需要治疗的靶细胞中对CFTR介导的氯离子跨膜运输产生显著的正向作用。

同年9月，一篇名为《Some like it hot: curcumin and CFTR》的短评[23]刊出，当然，这个标题也是玛丽莲梦露最卖座的电影名称，来自凯斯西储大学医学院的两位科学家在“hot”这个词上一语双关，对应了“姜黄”之“辣”，也寄希望于姜黄素能够延续之前的“热”度，给囊性纤维化病人带来真正的福音。即便是抱有如此乐观期待的科研短评，作者依然在文末指出：小鼠与人类△F508-CFTR之间可能存在的差异，必须考虑是否可以将来自小鼠的数据扩展到人类。有研究[24]表明，小鼠△F508-CFTR蛋白质可能比人类同源物到达细胞表面的效果要更好。而且，如果姜黄素在体内具有可重现性，则必须确定其持续时间。如果确定姜黄素是一种可行的治疗方法，就必须获得姜黄素的安全性数据。虽然在许多人的饮食中发现了这些化合物，但建议的治疗方法是长期使用高剂量，这一点尚未得到安全评估。此外，如果姜黄素能够继续被证明具有激活△F508-CFTR的活性，那么必须要了解它的药物动力学和药效动力学，并在囊性纤维化患者中验证其安全性和效果。虽然其他实验室无法证实Egan等最初的试验结果，但激活△F508-CFTR的可能性是具有如此重要的治疗意义，因此对姜黄素治疗囊性纤维化的潜力进行彻底的研究是有必要的。

时隔不久，又一篇驳斥姜黄素激活突变型CFTR的原创试验性论文[25]在2004年10月刊出，文章题目直指无论是之前的Thapsigargin还是现在的姜黄素，都无法促进错误折叠的CFTR蛋白成熟。这与Verkman实验室之前发表[18]的结论相印证。数据结果显示，将稳定表达△F508-CFTR突变型的BHK细胞，用不同浓度的Thapsigargin(0.0～1.0×10-5μmol/L)或姜黄素(0.0～3.0×10-5μmol/L)处理细胞18 h。结果显示细胞在27 ℃下培养可显著提高成熟CFTR的产量，这与其他[26]报道的结果相符。然而，当在Thapsigargin或姜黄素存在下培养细胞时，全细胞提取物的免疫印迹分析显示未检测到成熟CFTR的增加。因此，在ER中对△F508-CFTR-伴侣蛋白相互作用体系的简单破坏不太可能纠正错误折叠的CFTR突变蛋白质。事实上，先前已有研究[27]表明△F508-CFTR-伴侣蛋白相互作用的中断加速了蛋白酶体的降解。另外，此文也指出，在姜黄素达到最高浓度(3.0×10-5μmol/L)时，P-gp的产量减少，这印证了姜黄素在高浓度下引起细胞凋亡的事实。

这些负面报道，以及在2004年的传统囊性纤维化威廉斯堡(USA)会议上反对使用姜黄素的批评声音，都警告人们不要给患有囊性纤维化孩子的家庭虚无的希望。2005年1月，一篇科学评论文章[28]指出：关于姜黄素激活突变体CFTR的研究，由于后续的研究未能重现这些最初曾经令人兴奋的结果，导致人们对它的怀疑与日俱增。比如动物的遗传背景不同，或者姜黄素的来源不同，甚至给药和处理动物也可能有影响。推测姜黄素在体内的作用很可能与化合物中一种尚未识别的活性代谢物有关，而不是姜黄素本身。姜黄素治疗小鼠的死亡率降低也可能是姜黄素在治疗小鼠肠内的局部通便作用造成的。因此，尽管草本来源的膳食补充剂是理想的合成药物的替代品，但它们的功效需要在体内和体外进行仔细的评估。

2005年11月，又一篇原创试验性论文[29]报道，SERCA抑制剂姜黄素和Thapsigargin无法纠正△F508-CFTR小鼠中观察到的氯离子转运缺陷。检测从这些培养物中得到的高度敏感的免疫印迹或免疫沉淀物，在有和没有姜黄素的情况下都检测到明显的未成熟△F508-CFTR蛋白带。同时，Song等[18]的研究给小鼠注射15 mg/kg姜黄素后2 h 测血清，没有在血清中检测到姜黄素。然而，在100 mg/kg的剂量下，在给药后2 h，检测到3.6×10-8μmol/L的姜黄素，表明姜黄素的生物利用度非常低。而要强调的是，该团队在CF小鼠中的研究[29]超过了最初在Egan研究中描述的剂量和持续时间，并且扩大了研究规模，包括姜黄素的其他来源、延长的剂量持续时间等。然而，那些从耶鲁大学获得的△F508-CFTR缺陷型小鼠的鼻部电位差也未被姜黄素治疗和纠正。鉴于以上的结果，结合文献中未能检测姜黄素在纠正与△F508-CFTR相关的转运缺陷方面的任何数据，认为在CF人类临床试验中检测姜黄素的作用为时过早。

2.3 论证

在一片反对的声浪中，支持者也开始提供试验数据来声援Egan[30-31]。有报道[32-33]称，姜黄素通过减少通道闭合时间和延长通道保持开放时间来增加细胞膜片中的CFTR通道活性。这种激活是剂量依赖性的、可逆的，并且比用GST观察到的要大，GST是另一种刺激CFTR的化合物。姜黄素依赖的刺激需要磷酸化通道和ATP的存在。姜黄素只激活磷酸化的CFTR，其作用于高磷酸化通道时增强。此外，姜黄素浓度对CFTR的PKA磷酸化有部分抑制作用。这些结果表明，主要机制可能不直接涉及R区[32]。该团队声称[32]发现姜黄素提高了野生型和△F508通道的活性，加入姜黄素也能增加分化的非CF气道上皮的氯转运，但不能增加CF上皮的氯转运。这些结果提示姜黄素可能直接刺激CFTR氯离子通道。

据Wang等[34]报道，ATP与NBD1结合强烈抑制了姜黄素对NBD2缺失突变体的刺激作用，说明NBD1是一个可能的激活位点。姜黄素的激活在长时间暴露于这种混合物中时变得不可逆转，随后在没有任何激动剂的情况下，持续激活的通道会动态开启。有报道[35]称在突变型(G551D)CFTR中，姜黄素在全细胞电流中诱导了电压依赖性的增强，推测GST增强和姜黄素增强的G551D-CFTR可能具有不同的蛋白质构象。姜黄素增加G551D-CFTR全细胞及单通道电流小于GST在其最大有效浓度时的作用。此外，GST和姜黄素在较低浓度范围内联合应用可以协同修复G551D-CFTR的缺陷[36]。GST和姜黄素均显著增加cAMP-PKA刺激激活的G551D-CFTR全细胞电流，但二者增效作用的时间历程不同，即GST在启动和关闭过程中均比姜黄素作用快，姜黄素几乎是可逆地增强了G551D-CFTR(与之前报道的不可逆激活相比)[37]。姜黄素的增效作用小于GST，最高可溶浓度为6.0×10-5μmol/L。重要的是，姜黄素和GST对G551D-CFTR通道具有增强作用表明，二者通过不同的机制影响G551D-CFTR。

有研究[38]发现姜黄素处理中国仓鼠卵巢细胞抑制CRT表达，增加野生型CFTR，但不影响△F508-CFTR的表达。然而，虽然姜黄素没有增加△F508-CFTR的表达，但它增强了26 ℃孵育诱导的△F508-CFTR的功能，这与试验对照组的低温下siRNA敲除CRT的效果相似。因此，可以推论姜黄素对CFTR表达的积极作用是通过下调CFTR的负调控因子CRT介导的。

3 结论与展望

姜黄素的生物利用率和安全剂量始终是药物研发时最关心的问题之一。以2 g /kg体重质量的比率给小鼠口服姜黄素表现出最大的血清浓度为(1.35×10-3±0.23×10-3) g/L，(0.83±0.05) h，而人类使用相同剂量的姜黄素之后，最大血清浓度为(6×10-6±5×10-6) g/L，1 h[39]。同样，Yang 等[40]将姜黄素以500 mg/kg体重质量的比率给大鼠喂药，检查自由运动的大鼠血浆时，显示姜黄素仅有1%的生物利用度。此外，人口服48 g姜黄素后的血浆峰值为(0.41～1.75) mol/L，且在12 h时未观察到血药浓度峰值[4]。Sharma等[41]的前期研究结果显示，在人体临床试验中，口服3.6 g姜黄素1 h后，血浆中姜黄素水平降低至11.1 nmol/L，同时在血浆中和低浓度的尿液中进行了研究，结果表明在口服剂量为4 g以下时，血清中无法检测到姜黄素。

姜黄素能够激活野生型(WT)、△F508-CFTR[32]和G551D-CFTR[37]氯离子通道。Kirk等[34]报道姜黄素对CFTR有两大作用：增加CFTR的ATP独立激活和促进CFTR分子的低聚体形成。姜黄素即使在ATP缺失的情况下也能激活G551D-CFTR突变体和WT-CFTR。值得注意的是，姜黄素活化仍然依赖于蛋白激酶A对R区的预先磷酸化，这与R区在控制CFTR功能中发挥许可作用的观点一致。姜黄素诱导的G551D-CFTR和NBD2缺失结构的活化，是由于开放率的增加。此外，长时间接触姜黄素可诱导不可逆活化，活性强，短时间接触可诱导可逆活化，提示姜黄素可诱导CFTR分子发生不可逆构象改变。姜黄素诱导的CFTR寡聚体大多呈二聚体形式，这与纯化后的CFTR蛋白经天然PAGE电泳可呈二聚体形式[42-43]的结果一致。另外，姜黄素可能介导钙结合蛋白与CTFR之间的相互作用受到抑制，从而减少钙结合蛋白介导的CFTR在ER中的滞留和降解[44]。然而，其他研究没有发现△F508-CFTR在体外转移到质膜的证据或是能够令△F508-CFTR的门控开放增加。Song等[18]的活体试验不能证明口服姜黄素的小鼠鼻电位差增加。然而，Wang等[45]的体外试验证明姜黄素也是Fe3+的重要螯合剂，而Fe3+是一种能够抑制通道二聚化和开放的分子，无需R结构域磷酸化和ATP-二聚化为前提。

Egan等[15]认为姜黄素既能纠正△F508-CFTR胞内转运障碍又能激活其通道开放，可是却遭到美国、瑞士等不同国家好几个独立的科研团队的质疑。因为不同研究小组所用的细胞类型不同可能对结果产生严重影响。有些小组[46]的试验材料需要16 h以上才能够纠正△F508-CFTR细胞膜定位障碍，而Lipecha等[47]使用的CFPAC-1细胞△F508-CFTR定位到细胞膜上的时间仅仅为2 h。而在水/血清溶液中，姜黄素在很短时间内(t1/2<10 min)就会转变为其降解产物，这对试验结果的检测也构成非常大的误差。

姜黄素是从姜黄(姜黄)的根茎中分离出来的一种天然多酚化合物，具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗微生物和伤口愈合作用。关于姜黄素能否激活突变型CFTR氯离子通道的讨论自2004年一直持续至今，不断为这一学说添砖加瓦，丰富其内涵。姜黄素对野生型、△F508突变型和G551D突变型CFTR均具有激活作用，但是姜黄素不能纠正△F508-CFTR的胞内转运障碍。本文旨在综述姜黄素对突变体CFTR氯离子通道的作用机制，帮助更好地理解和整合姜黄素的药理活性的分子机制，为囊性纤维化的治疗提供有力的理论基础。