王晓乐，杨艳萍，付双彬，姚丽娟，曾爱平，应 震，周 庄

(浙江省农业科学院 亚热带作物研究所，浙江 温州 325005)

寒兰(CymbidiumkanranMakino)，兰属地生植物，株型修长健美，叶姿优雅俊秀，花色艳丽多变，香味清醇久远，为国兰之一，在我国具有悠久的栽培历史。寒兰大多于10月至翌年2月开花，花期较长，且早于大多数春天开花的兰科植物，导致不同种质资源(包括同属和不同属兰科植物)因花期不遇、地理隔离无法进行杂交，严重制约寒兰育种研究的发展。

花粉生活力测定与储藏性的研究是解决杂交亲本在空间与时间上的隔离进而扩大育种范围的前提，但目前未见针对寒兰花粉生活力检测及贮藏性的相关研究报道。早期花粉生活力的研究主要集中在萌发培养基的成分筛选上，尤其是蔗糖浓度的选择。Pritchard等[1]在1910年以2种欧洲兰花为材料，筛选出最适宜萌发的培养基蔗糖浓度为5%～10%；除此之外，以其他11种兰花花粉为材料，对其花粉萌发影响因素和贮藏特性进行了研究。邵青松等[2]研究金线莲花粉的萌发结果显示，花粉活力表现出先升后降的趋势，开花第3天的花粉活力最强，适当的低温可以延长花粉生活力。邓茜玫等[3]对聚石斛花粉生活力进行研究，筛选出了最适宜的花粉萌发培养基，开花8 d之前的花粉生活力均高于65%，作为父本授粉结实率高于85%；-20 ℃贮存90 d后花粉萌发率降为21.7%，杂交授粉后仍然能够正常结实。

本研究采用固体培养基，研究了蔗糖、氯化钙、硼酸对寒兰花粉萌发的影响，对比了不同干燥时间、贮藏温度、贮藏时间对花粉生活力的影响，以期筛选出寒兰花粉离体萌发最佳培养基和适宜的花粉贮藏方法，为有效开展寒兰杂交育种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验于2016年11月至2017年4月进行，材料为浙江省亚热带作物研究所大棚生长的浙江寒兰(简称寒兰)。

1.2 处理设计

1.2.1 花粉萌发培养基筛选

采用3因素4水平正交试验：蔗糖浓度设1%、5%、10%、15% 4个浓度梯度，单位为g·100 mL-1；氯化钙设10、50、100、150 mg·L-14个浓度梯度；硼酸设10、50、100、150 mg·L-14个浓度梯度。所有母液用针头滤器(Millipore，0.22 μm)灭菌，所有用水为无菌水。配置好所有正交试验组合之后，加琼脂至浓度为0.3%(单位为g·100 mL-1)，完全溶解后加2.5 mL固体培养基到40 mm一次性培养皿中铺板。取开花后3～5 d的花粉块于适量无菌水中吸胀30 min，用移液枪打散花粉团，每个培养皿点6个花粉斑，每个斑点3 μL。培养皿置于25 ℃生化培养箱内暗培养36 h，于生物显微镜(Olympus，BX53)下镜检，每个试验组观测最少5个视野，每个视野最少观察50个花粉粒，并统计萌发率。花粉萌发以花粉管长度大于花粉粒2倍直径为标准。

1.2.2 干燥时间对花粉萌发的影响

收集开花后3～5 d的花粉分装入3个10 mL圆底管中，置于干燥器中室温干燥1、2、3 d，以不干燥花粉作为对照。将4组花粉于-20 ℃贮存15 d，后转移至4 ℃放置2 h，30～35 ℃水浴锅复水30 min，进行花粉萌发试验。显微镜观察并统计结果。

1.2.3 低温贮存对花粉萌发的影响

收集开花后3～5 d的花粉，干燥1 d，分别置于4、-20、-80 ℃进行保存，于15、30、90 d检测不同贮存温度下花粉萌发率。-20、-80 ℃取出的花粉需梯度恢复至室温再进行复水。

2 结果与分析

2.1 培养基对寒兰花粉萌发的影响

氯化钙浓度对花粉萌发具有较大的影响(表1)。当氯化钙浓度为10、50 mg·L-1时，平均萌发率分别为79%和78%，浓度为100、150 mg·L-1时，平均萌发率则分别下降到69%和64%。蔗糖对寒兰花粉萌发影响仅次于氯化钙，最适宜浓度为1%，但与5%、10%浓度下的平均萌发率差异并不显著；当蔗糖浓度为15%时，其平均萌发率显著降低。硼酸对寒兰花粉萌发的贡献率相对最小，最适浓度为50 mg·L-1。由此正交试验得出的寒兰花粉萌发最优培养基组合为蔗糖1%，硼酸50 mg·L-1，氯化钙10 mg·L-1。

2.2 干燥时间对寒兰花粉萌发的影响

花粉含水量是影响花粉低温保存质量的重要因素，含水量越高，冷冻时越容易形成冰晶，细胞膜受损越严重，花粉死亡率就越高。结果显示：未经干燥处理的花粉萌发率为69%；干燥1 d的花粉在-20 ℃保存15 d，其萌发率最高可达79%；干燥2、3 d的花粉萌发率大幅降低，分别为38%和29%。

2.3 低温贮存对花粉萌发的影响

花粉的低温保存(4～-20 ℃)是一种操作简便、经济实用的花粉保存方法[4]，能延长花粉的

表1 不同培养基中寒兰花粉的萌发率

寿命，解决植物杂交育种中花期不遇及异地杂交的难题。本研究结果(表2)表明，3种不同温度下低温保存30 d，花粉萌发率均可达50%以上；其中，-80 ℃保存30 d的花粉萌发率最高，为66%，基本满足授粉结实的要求。低温保存90 d，-80 ℃保存的花粉萌发率急剧下降到40%，-20 ℃保存的花粉萌发率相对最高，为48%，4 ℃保存的花粉萌发率最低，仅为31%。

表2 低温贮存对寒兰花粉萌发率的影响

注: 同列数据后无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)

3 讨论

花粉是种子植物雄配子体或雄配子细胞的载体，其生活力决定了受精过程的成败，花粉萌发率则是衡量其生活力的重要指标。本研究通过正交试验筛选出寒兰花粉萌发的最优培养基，在此基础之上，进一步研究了干燥、低温对花粉贮藏性的影响。

蔗糖是大多数植物花粉离体萌发培养基必不可少的成分，不仅可以平衡培养基与花粉内外渗透压，还可为花粉管的生长提供碳源[5]，其最优浓度随物种的变化差异较大。除本研究中所用寒兰之外，香荚兰所需最佳蔗糖浓度也为5%[6]，聚石斛[3]、墨兰[7]、卡特兰[8]和白芨[9]的花粉萌发所需最佳蔗糖浓度均为10%；个别兰科植物花粉萌发需高浓度蔗糖，如无距虾脊兰[10]和大花蕙兰[11]，分别为20%和30%。除了浓度差别，碳源种类也会影响花粉萌发。杨文波等[6]研究表明，离体培养荚兰花粉萌发时，以5%的乳糖为碳源萌发率最高，其次是5%蔗糖，果糖效果最差。

花粉的离体萌发和花粉管生长都需要从培养基中吸收大量钙离子，降低培养基中的钙离子浓度能够明显抑制花粉萌发，因此，适宜的钙离子浓度是花粉体外萌发所必需的[12]。外源钙可以替代花粉萌发时的群体效应[13]。本试验中，钙离子浓度对寒兰花粉离体萌发影响显著，最适宜浓度为10 mg·L-1，高浓度钙离子会抑制花粉管萌发，与之相似的是墨兰，最适钙离子浓度仅为5 mg·L-1[7]。但在卡特兰离体萌发培养基中，钙离子可高达150 mg·L-1，但是只起辅助作用[8]，这可能是由于寒兰和卡特兰亲缘关系较远而造成的。

花粉贮存是解决花期不遇、地理隔离型生殖隔离的有效手段。本研究中，4 ℃贮存的寒兰花粉在所检测的时间点萌发率均最低；保存30 d，-80 ℃贮存的花粉萌发率最高；保存90 d，-20 ℃贮存的花粉萌发率最高。因此，若需长期保存花粉，推荐采用-20 ℃。部分超低温保存的植物花粉萌发率可以基本不变，甚至个别物种在保存过程中萌发率还出现上升的情况[14-15]。但本研究中，-80 ℃保存的寒兰花粉萌发率下降十分严重，原因可能是-80 ℃对缺乏冻存保护剂的花粉造成了损伤，降低了其萌发率[16]，未进行预冷冻和程序性降温也可能是导致花粉萌发率下降的原因之一。

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