李永萍，温书香

（1.漯河市召陵区动物卫生监督所，河南 漯河 462300；2.漯河市动物疫病预防控制中心，河南 漯河 462300）

1 病毒分离鉴定

就目前来说，鉴别诊断病毒种属最有效、最准确的方法是病毒的分离鉴定。常用于猪蓝耳病的分离培养的细胞主要有猪肺泡巨噬细胞、非洲绿猴肾细胞MA104以及其克隆株，不同的毒株类型对细胞系具有选择性，例如欧洲型毒株更适合于在猪肺泡巨噬细胞上生长。鉴于不同的毒株对生长条件的选择性，在病毒分离的同时，可以准备接种两种以上的细胞。

猪蓝耳病病毒对温度和PH也比较敏感，因此对病料的保存和运输要求比较严格，对于急性发病的猪只来说，采集病料成功分离病毒的概率比较大。在病猪的感染早期，肺组织、血清样品常用于分离病毒。在病猪感染的中期，采集猪的肺组织比血清样品更易于病毒的分离。此外，猪的口腔分泌物、精液等也可以作为病毒分离的材料。

2 病毒抗原的检测

单克隆抗体因其具有较高的特异性、不易发生交叉反应等优点常常被用来做猪蓝耳病病毒抗原的检测，用全病毒抗原或者多肽免疫产物作为免疫原获得了5种特异性的单抗，其中N蛋白的免疫原性最强。用猪蓝耳病全病毒免疫动物获得的单抗多半是针对N蛋白的抗原表位的，这些单抗中有的是针对欧洲型和美洲型共同的抗原表位，有的只对一个毒株类型起反应。因此，在对猪蓝耳病进行检测的同时还可以达到分离欧洲型和美洲型的目的。病毒抗原的检测主要用于对病毒分离物进行鉴定或者研究猪蓝耳病病毒的一个动态分布。猪感染蓝耳病病毒后，体内产生的抗体长期存在，再加上抗原检测时对病料的处理较为繁琐，因此血清学检测更适合于猪蓝耳病的检测和诊断。

3 血清学检测

血清学检测方法中常用的有以下几种，其中免疫过氧化物酶细胞单层实验在血清学检测过程中表现出特异性强、敏感性高等优点，已被畜牧兽医学界得到广泛的认可，该检测方法在欧洲、美洲和亚洲国家经常使用。该检测方法的主要原理是应用相应的毒株感染猪肺泡巨噬细胞和CL2621单层细胞作为诊断用的抗原，在细胞培养的5～6d就可以检测出抗体的存在。荧光抗体实验方法在美国、加拿大和日本等国家较为常用，该检测方法

敏感性和特异性都非常好，其抗原的制备过程与免疫过氧化物酶细胞单层实验的制备过程一致。但这两种方法有一个缺点就是这两种检测方法带有一定的主观性，不适合于大规模的临床样品检测。血清中和试验也常被用于猪蓝耳病的检测，这主要得益于血清中和抗体的持续时间要比免疫过氧化物酶细胞单层实验和荧光抗体试验的持续期长得多。但该方法也有不足的地方，例如该方法要求细胞培养，人力和财力资源的消耗比较大，检测条件要求非常高，更为重要的是猪在感染蓝耳病病毒后中和抗体出现的较晚。因此不利于疾病的早期诊断和急性病例的诊断。ELISA实验室目前应用较多的一种检测方法，该放操作过程简便快捷，判定标准统一，特异性和敏感性都较高，血清中ELISA抗体出现的时间较早，持续的时间都较长。用于血清样品检测的抗原主要有两种，一种是用细胞培养的全病毒，一种是重组的核衣壳蛋白，无论哪种抗原作为反应原，都难以消除较强的反应背景。

4 分子生物学检测方法

分子生物学检测方法常用的技术主要有原位杂交技术和RTPCR技术。其中原位杂交技术使用的探针主要针对猪蓝耳病的ORF7进行设计。该检测技术的敏感性高于免疫胶体金技术和免疫组化，检出的持续时间更长久。猪蓝耳病的毒株主要有美洲型和欧洲型，因此根据2种毒株核酸之间的差异设计探针，以此来区分基因型。此外，常规RT-PCR技术多用于对血清，精液和组织样品的检测。根据核酸片段设计的特异性引物还可以达到对毒株进行分型的目的。多重PCR技术在猪蓝耳病的检测上也经常用到，该技术可以同时检测2种和2种以上的病种，能够有效鉴定病例是由哪种病毒引起的。RT-PCR-RFLP技术的原理主要是将组织病料经过RT-PCR处理后，用限制性内切酶进行RFLP分析，不但可以鉴别不同毒株之间的差异，还可以鉴别疫苗毒株和野毒感染。RT-nested PCR技术的原理根据蓝耳病毒核酸设计一对通用引物，可以同时扩增欧洲型和美洲型片段，再设计一对引物能够有效区分2个毒株类型，从而达到检测和分型的目的。TaqMan荧光定量RT-PCR技术是近几年发展起来的实时荧光定量PCR技术，该检测技术具有灵敏性好，敏感性高，重复性和特异性好等优点。有研究表明该检测技术要比常规的检测方法的灵敏性高出100倍以上，但该技术也有一定的不足，例如，该技术的成本较高，设计的荧光探针对核酸序列的变化相当敏感。因此，该技术的关键点在于探针的设计。