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口蹄疫液相阻断ELISA实验中常遇问题及详细操作步骤

2018-02-15王秀东邹德颖郭兴那永东翟伟曹凯捷

畜牧兽医科学 2018年1期
关键词:移液器刻度口蹄疫

王秀东,邹德颖,郭兴,那永东,翟伟,曹凯捷

(盘锦检验检测中心,辽宁 盘锦 124010)

酶联免疫吸附实验(ELISA) 是一种用酶标记已知的抗原或抗体,并使之吸附在固相载体表面发生抗原抗体反应,用于检测大分子抗原和特异性抗体的技术[1]。在口蹄疫病毒抗体检测中,液相阻断ELISA实验是农业部规定的检验标准,判定结果较为客观,而且能够有效评价接种了FMD疫苗的动物的抗强毒攻击能力。由于酶联免疫吸附实验步骤较为复杂,且环环相扣,一旦某个环节出现问题,将影响到实验结果的准确性,因此必须明晰其实验流程及注意事项。

1 口蹄疫液相阻断ELISA实验中常遇问题

相对来说,口蹄疫液相阻断ELISA实验的过程是比较漫长的,实验者常遇到以下几个问题:①说明书过于精要,实验步骤不明晰,导致实验流程混乱,操作不严谨,还有可能会出现实验过程中用错试剂的情况;②在抗原抗体反应中,需要用到96孔U型板进行血清稀释,有时候实验者会将ELISA反应板与之混淆;③在抗原抗体反应稀释血清的环节,实验步骤较复杂,而且要两次调整移液器量程,如果没有按照实验步骤调整刻度值,将导致所加PBST液量错误,继而导致稀释倍数计算错误;④酶联免疫吸附板条未牢牢固定在板架上,在洗板甩干/脱干的环节容易脱落,如果之前未加标记,很容易分不清样品序号顺序 。

针对上述情况,可采取以下措施有效避免:①仔细阅读说明书,揣摩其中含义。逐字逐句阅读说明书,对于有疑问或不理解的词语,应自己查阅资料了解,如果不明确实验步骤,可以询问实验经验丰富的人,直到基本掌握实验操作步骤;②做好实验准备工作。在实验中,所用实验器材有5~50μL的单道移液器及多道移液器、50~300μL的多道移液器、、加样槽、废弃液瓶,以及20mL、50mL、250mL、500mL量筒,以及300mL、500mL烧杯,准备好足够数量的实验器材,检查试剂是否齐全,根据实验人员数量准备足够的96孔U型反应板。

2 口蹄疫液相阻断ELISA实验详细操作步骤

2.1 配备PBST液

一般情况下,一板实验需要用到500mL1倍PBST液,因此可根据实验板书计算药液用量,再使用25倍PBST浓缩液配置1倍PBST液。检查25倍PBST浓缩液平底有无结晶,如无可直接稀释,若有则置入水浴锅中直至结晶融化再稀释,20mL量筒量取20mL浓缩液,倒入500mL量筒中,加蒸馏水至500mL刻度线,混匀,倒入加样槽内。

2.2 抗原抗体反应

实验过程的具体步骤如下:①稀释血清。以每板检测10份血清为例,取洁净的96孔U型反应板,采用50~300μL的多道移液器,刻度调至75μL,吸取1倍PBST液加入A1~A10孔中;刻度调整至50μL,往A~H行的1~11列孔、A12、B12中加入1倍PBST液。使用5~50μL的单道移液器,吸取25mL检测血清,加入A1~A10孔中;将多道移液器的刻度调整至50μL,插入A1~A10孔中反复吸取数次,混匀,再吸取50μL药液,加入到对应的B列孔中,重复上述操作,将同一列的液体50mL吸取到下一行的孔中,直至H列,最后吸取50μL药液弃去,使得从A列到H行,血清稀释倍数依次为1∶4、1∶8……1∶512。在A11孔加入阳性血清50μL,采用相同的方式进行稀释,使其稀释倍数为1∶16、1∶32……1∶2048,在A12孔中加入阴性血清50μL,稀释至B12,稀释浓度分别为1∶2、1∶4;②添加病毒抗原。通常一板实验需要5mL抗原,根据实验板数计算工作浓度抗原数量,根据实际浓度,稀释抗原,并多配置2~3mL备用,按照说明书的要求加入反应板孔中,封板,轻微振荡,37℃恒温箱中放置90min。

2.3 余下实验步骤

在抗原抗体实验后,所需进行的实验步骤有:①转移抗体抗原混合液,根据说明将抗原抗体混合液转移至口蹄疫O型、A型或者亚洲I型相应的ELISA反应板中,每孔50μL,封板,37℃恒温箱中温育60min;②洗板。弃掉ELISA板中液体,移液器吸取1倍PBST液260至280μL置入孔中,再甩出,重复3~5次,吸水纸拍干;③添加口蹄疫O型或A型豚鼠抗体。往ELISA板各孔中加入ELISA板中50μL口蹄疫O型、A型或者亚洲I型豚鼠抗体,封板,37℃温育30min;④洗板;⑤加兔抗豚鼠酶结合物;⑥加底物;⑦加终止液,记录酶标仪刻度值。

3 结语

口蹄疫液相阻断酶联免疫吸附实验步骤繁多,如果做实验的人不严格按照实验步骤进行操作,很有可能得到不成立的实验结果,前功尽弃,影响到病毒抗体检测工作效率及质量[2]。对于实验者,尤其是初学者,在做实验之前,最好能够详细阅读说明书,不放过其中的任何一个字眼,仔细揣摩其中的意思,直到能够记住实验步骤及其中的一些注意事项。

[1]李世凤,吴得瑞.浅析影响口蹄疫O型液相阻断ELISA实验的因素[J].中兽医学杂志,2017,(01):72.

[2]王娟娟.口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测两种实验方法结果对比[J].吉林畜牧兽医,2017,38(08):5-6.

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