张雪娜　贾海滨　张丽秀

摘要：利用富集培养法从河北省典型煤矿区土壤中分离到1株4环高环芳烃（HMW-PAHs）降解菌，经形态特征观察和18S rRNA序列分析确定该菌株为镰刀菌属（Fusarium sp.），命名为Y15。通过室内摇瓶和土壤培养试验，研究了其对4环HMW-PAHs的降解性能。结果表明，室内摇瓶培养7 d后，Y15接种量为100 mL/L时，对初始浓度为 10 mg/L 的芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、[XCZ60.tif]（Chry）的降解效率分别为52.94%、32.14%、33.93%。其中，对Pyr的降解率随初始浓度的升高呈先升高后降低的趋势，在40 mg/L时降解率最高，为69.67%。Y15接种在PAHs污染的土壤中，经30 d培养试验，Y15对3种高环芳烃Pyr、BaA、Chry的总降解率为13.15%。在3种PAHs中，Y15对Pry的降解率显著高于对BaA、Chry的降解率（P<0.05）。从土壤酶活性变化规律看，与添加灭活菌液的对照组相比，添加菌液处理的土壤多酚氧化酶和过氧化物酶活性明显降低。综上所述，该菌株是1株能以4环HMW-PAHs为唯一碳源且具有高效降解功能的潜在降解菌。

关键词：芘；苯并蒽；[XCZ60.tif]；生物降解；镰刀菌

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0282-04

多环芳烃 （polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指由2个或2个以上苯环以角状、线状或簇状组成的一类持久性有机污染物，在环境中普遍存在，因具有致畸、致癌、致突变的性质而受到人们的重视[1-2]。其中，4环及4环以上的高环PAHs（HMW-PAHs），因其疏水性、亲脂性、稳定性更强，更不易被降解[3-4]，对自然环境和人体健康均造成极大威胁，其中，4环PAHs 中的芘（Pyr）、[XCZ60.tif]（Chry）、苯并[a]蒽（BaA）属于美国环境保护局列入优先控制污染中的16种PAHs。

目前，微生物修复是去除环境中PAHs的主要方式，微生物系统、多环芳烃污染物的类型、污染区域的地质化学条件是解决PAHs污染问题的3个重要条件，在已知污染物类型和污染区域条件的基础上，微生物系统成为PAHs生物降解的主导者[5]。从污染土壤中筛选高效降解菌是开展微生物修复的基础。白鹏等从石油污染区土壤分离筛选得到1株芘高效降解菌菌株，菌株ZQ5在30 ℃振荡培养16 d后对 150 mg/L 芘的降解率为90.31%[6]。李晓明等从焦化厂土壤中筛选出芘降解菌群，还有少量菌种筛选自海洋沉积物或污泥[7]，因此，在不同的典型污染土壤中进行筛菌工作对补充菌种资源库及修复特定环境下的PAHs污染问题尤为重要。目前为止，从煤矿区受PAHs长期污染的农田土壤中筛选降解菌株的工作尚未开展，可加强研究。同时，近年来，国内外对高分子量PAHs的微生物降解研究较少，而能够以高分子量PAHs为唯一碳源的微生物资源更少[8]。

因此，本研究拟通过富集培养，从典型煤矿区多环芳烃长期污染土壤中筛选高分子量PAHs的高效降解菌，通过形态学观察和18S rRNA序列分子生物学分析，对菌种进行鉴定，并通过室内摇瓶培养试验和室内土壤培养试验考察其对Pyr、BaA、Chry的降解能力，为微生物修复4环HMW-PAHs的环境提供资源保障和理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试菌株为笔者课题组前期富集、筛选、驯化、待鉴定的菌株。

供试土壤采自河北省典型煤矿区的农田污染场地，区内分布有焦化厂和钢铁厂等生产企业，土壤样品为受PAHs长期污染的老化土壤，Pyr、BaA、Chry的总含量达2 019.23 mg/kg。取 0～10 cm表层污染土壤，遮光风干后，过1 mm筛，混合均匀后，在4 ℃的冰箱内保存备用，其基本化学性质如表1所示。供试土壤样品的pH值为7.46。

多环芳烃芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、[XCZ60.tif]（Chry），均为分析纯。

无机盐液体培养基：0.20 g MgSO4·7H2O、0.02 g CaCl2·2H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、0.40 g KH2PO4、0.60 g Na2HPO4、0.02 g MnSO4·H2O、1.00 g NH4NO3、1.00 L蒸餾水（无机盐固体培养基在无机盐液体培养基的基础上加入 15～20 g琼脂）。

高氏一号固体培养基：2.000 g可溶性淀粉、0.050 g氯化钠、0.110 g硝酸钾、0.050 g磷酸氢二钾、0.050 g硫酸镁、0001 g硫酸亚铁、1.500～2.000 g琼脂、100 mL蒸馏水，pH值为7.4～7.6（高氏一号液体培养基在高氏一号固体培养基的基础上去掉琼脂）。

1.24环HMW-PAHs降解菌的筛选

富集：于100 mL已灭菌的无机盐液体培养基中放入5 g农田污染场地新鲜的土壤样品，150 r/min、30 ℃振荡培养 24 h 获得富集菌液，取1 mL富集菌液接种到高氏一号培养基中进行培养。

筛选与纯化：将上述在高氏一号培养基中培养后的富集菌液经含PAHs的无机盐培养基进行筛选，并经多次转接纯化后获得多株纯化菌株。

驯化：将已筛选出的所有纯菌接种到表层含120 μg 4环PAHs的无机盐固体培养基中进行冲击，30 ℃下培养7 d后观察菌落生长状况，得到目标降解菌株，将所述目标降解菌株接种到表层含12、24、48 μg 4环HMW-PAHs的无机盐固体培养基中进行逐级驯化，30 ℃下恒温培养7 d后，生长良好，将驯化后的菌株进行鉴定，并用甘油冷冻保存于-70 ℃冰箱，备用。endprint

1.34环HMW-PAHs降解菌的鉴定

1.3.1形态观察及鉴定

将已充分活化的菌株接种到高氏一号固体培养基中，30 ℃培养48 h后观察菌落，并在高倍显微镜下观察菌株孢子、菌丝的形态学特征。

1.3.2菌株的分子生物学鉴定

以菌株基因组DNA为模板，用真菌核糖体rRNA区通用引物（ITS1、ITS4）进行18S rRNA扩增，PCR产物进行电泳检测，将扩增片段回收、测序，根据18S rRNA的测序结果，利用Blast软件在GenBank中与其他已测定的标准菌株的18S rRNA序列进行同源性比较。

1.4菌株对无机盐液体培养基中Pyr、BaA、Chry 的降解特性

1.4.1菌悬液制备

取1 mL驯化后保存的菌液，接种于高氏一号固体培养基中，30 ℃，150 r/min振荡培养7 d后得到目标菌株，将其接种于100 mL高氏一号液体培养基中，同样条件培养48 h后得到富集菌液。

1.4.2菌株对Pyr、BaA、Chry的降解试验设计

在100 mL三角瓶中加入18 mL无机盐溶液灭菌后，添加一定量4环PAHs单体母液，待丙酮挥发后，接入10%的富集菌液，使PAHs单体Pyr、BaA、Chry的终浓度均为10 mg/L，以不添加富集菌液的处理作为对照组，均在150 r/min、30 ℃摇床中遮光振荡培养7 d，每个处理设置3个重复。试验方案如表2所示。

1.6样品测定指标及方法[HJ1.45mm]

土壤基本理化性质：采用土壤农化常规分析法[9]测定。

PAHs无机盐溶液测定指标：Pyr、BaA、Chry测定方法参照文献[10-12]。在三角瓶中加入20 mL色谱纯正己烷，超声提取5 min后，使粘在壁上的PAHs全部浸到正己烷溶液中，再将三角瓶置于250 r/min振荡器中，振荡提取40 min后，再次超声提取5 min，静置分层后吸取1 mL上层正己烷溶液转移至2 mL顶空进样瓶中，待测。

土壤中HMW-PAHs测定指标及其分析方法：土壤中PAHs含量以风干质量计量，称取20 g土壤样品及10 g无水硫酸钠，混合均匀后，加入20 μL替代物（浓度为20 μg/mL的氘代三联苯与4-溴-2氟联苯的正己烷溶液），用丙酮与正己烷体积比为1 ∶1的提取剂索氏提取12 h，并经过干燥、浓缩、净化、再次浓缩后用正己烷定容至1 mL，待测[12-13]。

土壤酶活性测定指标及其分析方法：土壤多酚氧化酶活性采用邻苯三酚比色法测定，以1 g风干土壤样品2 h内生成的紫色没食子素的毫克数表示；土壤过氧化物酶活性测定与多酚氧化酶活性的测定方法相同[14]。

仪器：气相色谱仪-质谱仪联用，气相色谱仪为安捷伦6890，质谱仪为美国HP5972系列。

质量控制：回收率和检测线的测定参考EPA标准方法，回收率测定采用土壤基质加标法[15]。

1.7数据统计分析

无机盐溶液中多环芳烃降解率=（对照组PAHs含量-试验组PAHs含量）/对照组PAHs含量×100%。

土壤中HMW-PAHs的降解率Rs=（C0-Ct）/C0×100%。其中，C0为对照组土壤中HMW-PAHs的含量，Ct为试验组土壤中HMW-PAHs的含量。

试验数据采用Excel 2003和SPSS 17.0进行统计分析。

2结果与分析

2.14环HMW-PAHs降解菌株的形态鉴定与18S rRNA分子生物学鉴定

菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上30 ℃培养 48 h 后，培养基无色，菌丝生长密致，菌落的表面棉絮状；分生孢子呈镰刀形，分生孢子座为浅紫色，0～3个分隔，多数无隔。

对菌株的18S rRNA进行PCR扩增，经过1%琼脂糖凝胶电泳检测获得大小约500 bp的产物，扩增产物回收后进行测序，得到18S rRNA的序列为526 bp（图1）。利用Blast软件在GenBank中与其他标准菌株的18S rRNA序列进行同源性比较，该菌株18S rRNA序列与镰刀菌属真菌的18S rRNA序列相似性高达99%。结合菌株的形态特征分析与18S rRNA的结果，鉴定此菌株为镰刀菌属（Fusarium sp.），命名为Y15。

2.2Y15菌株对无机盐培养液中Pyr、 BaA、Chry的降解特性

将Y15菌液加入分别含有10 mg/L Pyr、 BaA、Chry的无机盐液体培养基中，7 d后测定Y15对3种HMW-PAHs的降解效果。由图2可知，Y15菌液对Pyr、 BaA、Chry的降解率分别为5294%、32.14%、33.93%。经检验，Y15菌液对Pyr的降解率显著高于对BaA、Chry的降解率（P<0.05），说明Y15菌株能够分别以Pyr、BaA、Chry为唯一碳源和能源进行代谢繁殖。

由图3可知，随着Pyr初始浓度的升高，Y15菌株对Pyr的降解率呈现先升高后降低的趋势，当Pyr的浓度为40 mg/L时降解效果较好，降解率高达69.67%，显著高于对其余两者的降解率（P<0.05），分别是其余两者的1.32、2.01倍。由此可见，Y15菌株對高浓度的HMW-PAHs有较强的耐受能力。

2.3Y15菌株对老化污染土壤中Pyr、 BaA、Chry的降解效果

由图4可知，添加Y15菌液的处理中Pyr、 BaA、Chry分别降低了15.02%、11.50%、12.20%，Y15菌株对4环 HMW-PAHs的总降解率达到了13.15%。根据单体去除效果可知，Y15对土壤中Pyr的降解效果显著好于对BaA、Chry的降解效果（P<0.05），这说明Y15菌液对老化污染土壤中Pyr、 BaA、Chry均有一定的降解能力，且对Pyr的降解能力较强。endprint

2.4不同处理下土壤酶活性的显著性分析

由表5可知，与对照相比，加入Y15菌液后，土壤多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性显著降低。对照处理土壤多酚氧化酶活性是施加Y15菌液处理中多酚氧化酶活性的1.62倍，与对照组处理相比，施加Y15菌液处理组过氧化物酶活性降低了23.83%。

3结论与讨论

经过对典型煤矿区土壤中多环芳烃含量的检测，证明土壤已经受到高浓度多环芳烃的严重污染[16]。在本研究中，在典型煤矿区土壤中分离到1株可分别以Pyr、 BaA、Chry为唯一碳源和能源的降解菌Y15菌株，经形态观察和18S rRNA分子生物学分析，初步鉴定其属于镰刀菌属。该菌株能够利用、降解多种HWM-PAHs。目前，能够降解HMW-PAHs的菌株一般多为细菌[17-21]，真菌中对白腐真菌研究最多[22-24]，对镰刀菌属降解HMW-PAHs的研究也仅见零星报道[25]。

在本研究摇瓶培养试验中，7 d后Y15菌液对初始浓度为10 mg/L的Pyr、 BaA、Chry降解率达52.94%、32.14%、33.93%。而Ortega-González等以50 mg/L的Pyr为唯一碳源，14 d后，镰刀菌属对Pyr的降解率为51.32%[25]；丝状真菌宛氏拟青霉30 d对BaA的单一体系的降解率为1718%[26]。这可能是由于菌株筛选地点不同其降解PAHs的能力存在差异，也可能是由摇瓶试验培养的环境、时间不同所致。从煤矿区土壤筛选的镰刀菌属Y15菌株是一种优良的4环HMW-PAHs降解菌，对4环HMW-PAHs具有很好的降解潜力。此外，Y15对较高浓度及较低浓度的Pyr均有一定的降解效果，但是降解效果显著低于最适降解浓度（P<0.05），这与其他学者的研究结果[6，27-28]一致。可能是由于Y15将Pyr作为唯一碳源，Pyr浓度过低则菌体对底物的竞争作用会影响其生长，或者是 PAHs浓度低时不能快速诱导产生裂解酶[27]；而过高浓度的Pyr以及Pyr代谢的中间产物的累积可能对降解菌起到了一定的毒害作用[6，28]，抑制了Y15的生长。

土壤培养试验中，通过向灭菌老化污染土壤的土壤样品中添加镰刀菌属Y15菌株的菌液以提高 PAHs 的降解效率，Y15菌液对Pyr、 BaA、Chry降解率分别为15.02%、1150%、12.20%，对4环PAHs的降解率为13.15%。Potin等将镰刀菌属等降解菌加入到未灭菌老化土壤中，30 d后，镰刀菌属对4环PAHs的降解率为22%[29]，这可能是由土壤的理化性质、菌种、接菌量不同所致[30]，也可能是因为镰刀菌菌液中营养物质加入未灭菌土壤中影响了土著微生物的生长，促进其生长，提高PAHs的降解效果[31]。就土壤酶活性而言，多酚氧化酶活性与对照组相比显著降低（P<0.05），与Liu等的结论[32]一致。

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