李静泉　高坤　许继飞

摘要：从内蒙古大唐国际托总托发电有限责任公司储煤区土壤样品中筛选到1株拮抗菌株NDY-10及被其抑制的菌株NDD-1。通过菌落形态和显微镜观察，结合16S rRNA、gyrB基因比对分析对菌株进行鉴定；采用牛津杯法对菌株NDY-10进行抑菌谱试验；通过紫外线照射、不同温度、不同pH值等处理对菌株NDY-10发酵上清液对菌株NDD-1的抑菌活性及稳定性进行研究。结果表明，经鉴定，菌株NDY-10、NDD-1分别为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、土壤芽孢杆菌（Solibacillus sp.）。短小芽孢杆菌NDY-10对土壤芽孢杆菌NDD-1、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用依次减弱，而对枯草芽孢杆菌、酵母菌、青霉菌没有抑制作用；短小芽孢杆菌NDY-10发酵上清液抑菌活性受热处理影响较大，受紫外线照射处理影响较小，在pH值为5～9范围内保持较高的稳定性。首次报道了短小芽孢杆菌对土壤芽孢杆菌的抑菌作用。

关键词：短小芽孢杆菌；土壤芽孢杆菌；分离；鉴定；抑菌；特性

中图分类号： Q93-331文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0091-05

由于短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）在植物病害防治[1-3]、微生态制剂[4-5]、水环境保护[6-8]等方面具有巨大的应用潜力，因此近年来逐渐成为研究热点。已有研究表明，短小芽孢杆菌对多种病原性微生物具有抑菌作用。郑敏筛选出1株短小芽孢杆菌，在平板试验中对芒果炭疽病病原菌的抑制率为88.87%，在活体试验中该株菌的抑菌率高于80%，可有效降低芒果自然腐烂[9]。胡晓璐等以水稻稻瘟病病菌（Magnaporthe grisea）為试验菌株，发现短小芽孢杆菌DX01对水稻稻瘟病病原菌孢子萌发的抑制率为36%[10]。Ghasemi等从伊朗高盐环境中筛选出1株短小芽孢杆菌，发现它可分泌2种几丁质酶（ChiS、ChiL），可抑制多种植物病原菌[11]。于婷等对分离出的短小芽孢杆菌BSH-4菌株及其抗菌蛋白进行抑菌谱研究，发现它对8种常见蔬菜病原真菌具有抑制作用，其中对黄瓜蔓枯病病菌、番茄早疫病病菌和黄瓜立枯病病菌具有较高的抑菌活性[12]。彭虹旎对筛选出具有抑菌活性的短小芽孢杆菌4D-14进行研究，确定其分泌的抗菌物质为小肽类，受蛋白酶影响不大，具有较高的热稳定性[13]。颜爱勤等的研究结果表明，短小芽孢杆菌JK-SX001菌株产生的非蛋白抗菌物质造成病原菌菌丝顶端畸形，形成膨胀，强烈抑制病原真菌菌丝生长，同时通过抑制病原菌孢子产生芽管来抑制分生孢子的萌发[14]。Aunpad等从短小芽孢杆菌中首次分离到pumilicin 4细菌素，对耐万古霉素肠球菌（VRE）和一些革兰氏阳性细菌有显著的抑制作用，经鉴定这种细菌素属于多肽类物质[15]。但有关短小芽孢杆菌对芽孢杆菌属及其近缘属菌株的抑菌作用却未见报道。本研究分离得到1株拮抗菌株——短小芽孢杆菌NDY-10（B. pumilus NDY-10）及被它抑制的土壤芽孢杆菌NDD-1菌株（Solibacillus sp. strain NDD-1），扩大了短小芽孢杆菌抑菌作用的范围，并研究了短小芽孢杆菌NDY-10的抑菌谱及该菌株对土壤芽孢杆菌NDD-1菌株的抑菌活性。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1土壤样品

土壤样品，采自内蒙古大唐国际托克托发电有限责任公司的煤炭储藏区。

1.1.2主要试剂

牛肉浸膏、葡萄糖、细菌学蛋白胨、酵母提取物、NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、琼脂粉，均为化学纯。

1.1.3培养基

牛肉膏蛋白胨液体培养基：0.5%牛肉浸膏，1.0%细菌学蛋白胨，1.0% NaCl，用3 mol/L NaOH调节pH值至7.2，121℃高压灭菌30 min。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：每100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入1.5 g琼脂粉配制而成。

水琼脂培养基：蒸馏水加琼脂粉至终浓度为1.5%，121℃高压灭菌30 min。

马丁式培养基：1.00%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，1.50%琼脂粉，121℃高压灭菌30 min。

1.1.4主要设备

PowerCycler SL 96 Gradient型PCR仪，购自Analytik Jena AG；GBOX型凝胶成像仪，购自Gene Company Limited；UV-2600A型紫外-可见分光光度计，购自尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1菌株的分离、鉴定

采用稀释平板涂布法从土壤样品中分离菌种。向150 mL无菌三角瓶中加入45 mL灭菌水和适量已灭菌小玻璃球，称取5 g土壤样品加入三角瓶中，制成土壤悬液，于30 ℃摇床振荡2 h。用移液器吸取1 mL土壤悬液于无菌试管中，加入9 mL无菌水，混匀后从中吸取1 mL加入第2个无菌试管中并加入9 mL无菌水，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 6个稀释梯度的土壤悬液。分别吸取200 μL 10-4、10-5、10-6 3个稀释梯度的土壤悬液均匀涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，于28 ℃培养箱中倒置培养3 d。在分离菌株资源过程中发现有拮抗菌及被抑制菌存在，分别挑取、纯化，并验证其抑菌效果，将拮抗菌命名为NDY-10，将被抑制菌命名为NDD-1，进行菌株鉴定。对菌株进行划线培养，观察菌落形态，并对菌株分别进行革兰氏染色和芽孢染色，显微镜下观察染色结果。

采用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，对菌株的16S rRNA基因和gyrB基因[16-18]分别进行PCR扩增、测序、构建系统发育树。16S rRNA基因PCR扩增所用引物为27F、1492R，引物序列：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。endprint

1.2.2短小芽孢杆菌NDY-10抑菌谱测定

为了检测NDY-10菌株的抑菌谱，除NDD-1菌株外再选择2种革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）、1种革兰氏阴性菌（大肠杆菌）及2种真菌（青霉菌、酵母菌）进行NDY-10菌株的抑菌谱试验。供试菌株及来源信息见表1。

使用牛津杯法检测NDY-10菌株的发酵液对6种供试菌株的抑菌作用。先在培养皿中倒入10 mL左右的水琼脂培养基，待其冷却后，对供试菌株作下述处理：对于细菌供试菌株，将装有50 mL牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的三角瓶灭菌后，待其降至60 ℃左右时加入1 mL供试细菌菌株菌液，轻轻转动使菌液均匀分布在培养基中，在水琼脂平皿中倒入10 mL左右已加入菌液的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；真菌供试菌株接入马丁式培养基中作相同处理。待培养基凝固，在平皿中等间距放入3个牛津杯，轻轻加压使牛津杯固定在培养基上，每个牛津杯中加入100 μL NDY-10菌株发酵液。细菌在 37 ℃ 的恒温培养箱中培养7 d，真菌在28 ℃恒温培养箱中培养7 d。

1.2.3短小芽孢杆菌NDY-10的抑菌活性及其稳定性测定

NDY-10菌株在220 r/min、37 ℃摇床中培养2 d，12 000 r/min 离心15 min，收集上清液。无菌条件下，对发酵上清液作如下处理。80 ℃处理：上清液在80 ℃水浴锅中水浴1 h；121 ℃处理：上清液在灭菌锅中121 ℃条件下处理 30 min；将上清液用3 mol/L HCl、NaOH分别调节pH值为3、5、9、11，处理1 h，分别记为pH3、pH5、pH9、pH11处理组；紫外处理：将上清液在超净工作台中于紫外线照射下处理1 h；对照：不作任何处理。

然后将高温处理过的发酵上清液降至室温，将不同酸碱度处理过的发酵上清液pH值调为7.8。

分别取上述处理过的和未处理的发酵上清液各6 mL于试管中，向每支试管中加入3 mL NDD-1菌株菌液；同时设置空白对照组，其处理方法为6 mL牛肉膏蛋白胨培养基与3 mL NDD-1菌株菌液混合。在37 ℃、220 r/min摇床中发酵培养6 h，测定培养前、培养后菌液的D600 nm。每个处理3次重复，D600 nm取平均值。

抑菌率计算公式：

2结果与分析

2.1菌株鉴定

拮抗菌株NDY-10为革兰氏阳性菌，菌落外圈呈现半透明状态，中间乳白色，形状不规则，菌落扁平，边缘不整齐，表面湿润、光滑，有黏性；在顯微镜下观察菌体呈细杆状，比较长，多数单独存在，少部分成链排列，芽孢为近端生。将菌株NDY-10的16S rRNA、gyrB基因序列进行BLAST比对分析，发现菌株NDY-10的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中短小芽孢杆菌（B. pumilus）的16S rRNA基因序列相似性最高，最大相似度达99%。菌株NDY-10的gyrB基因序列与B. pumilus HTC38的gyrB基因序列相似度为99%（覆盖率87%），与B. pumilus LLTC93的gyrB基因序列相似度为98%（覆盖率86%），与B. pumilus NJ-V2的gyrB基因序列相似度为91%（覆盖率97%），与B. pumilus SH-B9的gyrB基因序列相似度为90%（覆盖率99%）。因此，将菌株 NDY-10鉴定为短小芽孢杆菌（B. pumilus）。B. pumilus NDY-10的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KT036668，其gyrB基因序列的GenBank登录号为KT036670。菌株NDY-10的16S rRNA、gyrB基因序列系统发育树分别如图1、图2所示，聚类结果与BLAST比对分析结果一致。

被抑制菌株NDD-1为革兰氏阳性菌，菌落呈半透明状态，淡黄色，圆形，菌落饱满凸起，边缘整齐，表面湿润、光滑，有黏性，在显微镜下观察菌体呈短杆状，多数单独存在，少部分成链排列，芽孢为端生，芽孢呈圆形，而芽孢杆菌属菌株的芽孢呈椭圆形，这是土壤芽孢杆菌属（Solibacillus）菌株区别于芽孢杆菌属（Bacillus）菌株的一个重要特征[19]。将菌株NDD-1的16S rRNA基因序列和gyrB基因序列进行BLAST比对分析，发现菌株NDD-1的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的Solibacillus、Bacillus中部分菌株的16S rRNA基因序列的相似度均达到99%。菌株NDD-1的gyrB基因序列与土壤森林芽孢杆菌（S. silvestris） StLB046的gyrB基因序列相似度为 92% （覆盖率99%）， 与S. silvestris DSM 12223的 gyrB 基因序列相似度为 91%（覆盖率99%）， 与B.

表现出不同的抑菌活性。

高温处理后，NDY-10菌株发酵上清液对NDD-1菌株的抑菌率下降。80 ℃处理后其抑菌率下降至37.2%，相对抑菌活性为4757%；而121 ℃处理后其抑菌率下降至23.7%，相对抑菌活性为30.31%。表明热处理对NDY-10菌株发酵上清液的抑菌活性有明显的影响。

在pH值分别为3、5、9、11的处理条件下，NDY-10菌株发酵上清液对NDD-1菌株的抑菌率分别为30.9%、693%、72.5%、413%，相对抑菌活性分别为39.51%、8862%、92.71%、5281%。可见在pH值为5～9的处理范围内，其发酵上清液的抑菌活性保持较高的稳定性，抑菌率高于69%，相对抑菌活性高于88%。

紫外线处理后NDY-10菌株发酵上清液对NDD-1菌株的抑菌率为66.4%，相对抑菌活性为84.91%，可见紫外照射对NDY-10菌株发酵上清液的抑菌活性影响较小。endprint

3讨论与结论

本研究从内蒙古大唐国际托克托发电有限责任公司储煤区土壤中分离、筛选到1株拮抗菌株NDY-10及被其抑制的菌株NDD-1，经鉴定，两者分别为短小芽孢杆菌、土壤芽孢杆菌。在已报道的抑菌性短小芽孢杆菌中，如B. pumilus DX01[10]、B. pumilus SG2[11]、B. pumilus BSH-4[12]、B. pumilus 4D-14[13]、B. pumilus JK-SX001[14]、B. pumilus WAPB4 [15]等均未见有关短小芽孢杆菌对芽孢杆菌属及其近缘属菌株的抑菌作用的报道。B. pumilus NDY-10对S. sp. strain NDD-1的抑制作用扩大了短小芽孢杆菌抑菌作用的范围。同时通过抑菌谱试验发现，B. pumilus NDY-10虽然对S. sp. strain NDD-1具有非常强的抑制作用，但对枯草芽孢杆菌却无抑制作用，说明B. pumilus NDY-10对芽孢杆菌属及其近缘属菌株的抑制作用具有选择性，其选择抑制的机制有待进一步研究。

对B. pumilus NDY-10发酵上清液的抑菌活性及稳定性进行研究，结果显示，其发酵上清液的pH值为7.8时，抑菌率为78.2%；抑菌活性受热处理的影响较大，80 ℃处理后其抑菌率下降至37.2%，121 ℃处理后，其发酵液的抑菌率下降至23.7%；抑菌活性受紫外线处理的影响较小，紫外线处理1 h后，其发酵上清液的抑菌率为66.4%；在pH值为5～9的范围内其发酵上清液保持较高的抑菌活性，抑菌率高于69%。

参考文献：

[1]邱德文. 我国植物病害生物防治的现状及发展策略[J]. 植物保护，2010，36（4）：15-18.

[2]李凯，袁鹤. 植物病害生物防治概述[J]. 山西农业科学，2012，40（7）：807-810.

[3]沈新迁，胡晓璐，刘通，等. GFP标记的短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）转座突变株的构建初探[J]. 上海交通大学学报（农业科学版），2012，30（4）：15-20.

[4]Telang S，Patel P，Sarangdhar V，et al. Isolation and cloning of the endoglucanase gene from Bacillus pumilus and its expression in Deinococcus radiodurans[J]. Biotech，2014，4（1）：57-65.

[5]Tangahu B V，Abdullah S R S，Basri H，et al. Biosorption of lead （Pb） by three Bacillus species （Bacillus cereus，Bacillus pumilus and Bacillus subtilis） isolated from Scirpus grossus[M]// From Sources to Solution. Singapore：Springer，2014.

[6]Guan Z B，Song C M，Zhang N，et al. Overexpression，characterization，and dye-decolorizing ability of a thermostable，pH-stable，and organic solvent-tolerant laccase from Bacillus pumilus W3[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic，2014，101（1/2）：1-6.

[7]慕娟，問清江，党永，等. 短小芽胞杆菌产碱性木聚糖酶发酵条件的研究[J]. 微生物学杂志，2012，32（2）：73-78.

[8]问清江，慕 娟，党永，等. 紫外诱变选育高产碱性木聚糖酶优良短小芽胞杆菌[J]. 陕西农业科学，2014，60（12）：1-6.

[9]郑敏.芒果炭疽病挥发性抑菌物质产生菌的筛选及拮抗机理研究[D]. 泰安：山东农业大学，2013：35-40.

[10]胡晓璐，陈云鹏，沈新迁，等. 短小芽胞杆菌DX01菌株Tn5转座突变株的抑菌活性筛选体系的建立[J]. 植物保护学报，2012，39（5）：406-410.

[11]Ghasemi S，Ahmadian G，Sadeghi M，et al. First report of a bifunctional chitinase/lysozyme produced by Bacillus pumilus SG2[J]. Enzyme and Microbial Technology，2011，48（3）：225-231.[HJ1.67mm]

[12]于婷，尚玉珂，李艳芳，等. 短小芽孢杆菌BSH-4抗菌物质的提取及其特性[J]. 植物保护学报，2009，36（1）：65-69.

[13]彭虹旎. 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus 4D-14）的分离与分子鉴定、抑菌性及微生态制剂应用研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2013：81-83.

[14]颜爱勤，吴小芹，叶建仁，等. 短小芽孢杆菌JK-SX001非蛋白抗菌物质研究[J]. 南京林业大学学报，2012，36（3）：13-16.

[15]Aunpad R，Na-Bangchang K. Pumilicin 4，a novel bacteriocin with anti-MRSA and anti-VRE activity produced by newly isolated bacteria Bacillus pumilus strain WAPB4[J]. Current Microbiology，2007，55（4）：308-313.

[16]Yamamoto S，Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with Universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（3）：1104-1109.

[17]郝云婕，韩素贞.gyrB基因在细菌系统发育分析中的应用[J]. 生物技术通报，2008（2）：39-41.

[18]曹凤明，杨小红，马鸣超，等. 枯草芽孢杆菌近缘种群鉴定方法研究进展[J]. 微生物学通报，2014，41（5）：968-974.

[19]Krishnamurthi S，Chakrabarti T，Stackebrandt E. Re-examination of the taxonomic position of Bacillus silvestris Rheims et al. 1999 and proposal to transfer it to Solibacillus gen. nov. as Solibacillus silvestris comb. Nov.[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology，2009，59（5）：1054.

[20]刘波，王阶平，陶天申，等. 芽孢杆菌属及其近缘属种名目录[J]. 福建农业学报，2015，30（1）：38-59.endprint