杨昭　何春兰　李芬芳

摘要：针对青香蕉果肉组织富含多糖、多酚类物质的特点，采用改良热硼酸法提取青香蕉果肉组织中的总RNA，探讨提取缓冲液pH值、离子浓度、CaCl2浓度、处理温度、处理时间、LiCl沉淀时间对总RNA提取质量的影响，并用异丙醇简化LiCl沉淀总RNA过程。结果表明，获得了1种快速提取青香蕉果肉组织中总RNA的方法，经逆转录PCR（RT-PCR）验证，该方法适用于黄香蕉果肉、黄香蕉果皮、香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮中总RNA的提取。

关键词：热硼酸法；青香蕉；异丙醇沉淀；总RNA

中图分类号： S668.1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0049-05

香蕉是世界上贸易量很大的水果，被联合国粮农组织定位为发展中国家的第4大粮食作物[1]，也是我国南方的五大名果之一，是国内重要的消费和出口资源。由于香蕉重要的经济价值，各国科学家关于香蕉功能基因的研究成为一个热点。特别是2012年法国科学家领导的国际小组对二倍体香蕉DH-Pahang基因组序列进行了测定[2]，吸引了更多的研究人员关注香蕉功能基因的研究。香蕉组织总RNA的提纯是进行香蕉功能基因研究的必要前提，在进行RNA分析、逆转录PCR（RT-PCR）、cDNA合成、Northern杂交、cDNA文库构建、功能基因筛选过程中都需要有高质量、高纯度、完整性好的总RNA。

目前已有多篇文献报道香蕉组织总RNA的提取方法，这些方法主要是十二烷基硫酸钠（SDS）法[3-8]、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[9-12]、TRIzol法[13]。这些报道仅研究单一提取方法或对几种提取方法的提取效果进行比较，并未对影响香蕉组织总RNA提取的关键因素进行分析。一旦提取過程中出现RNA纯度低、质量差的情况则很难分析其原因。因此，有必要了解在提取过程中影响RNA质量的详细因素，以便有针对性地解决提取总RNA过程中的问题。

笔者所在课题组在进行香蕉多酚氧化酶基因克隆研究中，须从青香蕉果肉中提取总RNA用于研究。但是青香蕉果肉的硬度、果胶含量、多酚含量均高于成熟香蕉[14-15]，采用RNA提取试剂盒和相关文献报道的方法，均不能获得合格的RNA。香蕉组织细胞内的多糖、多酚及色素等次生物质，在RNA提取过程中很难去除干净[16]。多糖等杂质的存在不仅会使RNA的溶解度降低，还可以抑制许多工具酶的活性，且多酚、色素等物质在提取过程中很容易被氧化而导致RNA变性，影响RNA用于进一步的分子操作，因此，能否在提取过程中尽可能多地去除这些干扰物质是获得高质量RNA的关键[17-19]。

热硼酸法提取植物组织总RNA已被多次改良，应用于富含多酚的不同作物、组织总RNA的提取[20-21]。但是目前，未有关于热硼酸法提取青香蕉果肉组织总RNA过程中影响其质量的因素研究。在本研究中，笔者对热硼酸法提取青香蕉果肉总RNA全过程中的各种影响因子进行了分析，拟摸索出一种既快速又高效地提取青香蕉果肉总RNA的方法，以期为深入开展香蕉功能基因的研究奠定良好的基础，同时为其他富含多糖、多酚类植物的总RNA提取提供借鉴。

1材料与方法

1.1试验材料

巴西香蕉果实、花采摘于中国热带农业科学院海口实验站实验基地（福山实验基地）。将采收的香蕉花、青香蕉、黄香蕉的果肉、果皮分离后分别用液氮速冻，置于-70 ℃冰箱保存。

1.2试验仪器

SuperRT cDNA Kit（CW0741），北京康为世纪生物科技有限公司；超微量分光光度计（Nanodrop 2000），美国Thermo公司；PCR仪（Tpersonal 48），德国Biometra公司；凝胶成像系统（G：BOX/EF2），美国Syngene公司；核酸电泳仪（DYCP-31F），北京市六一仪器厂。

1.3香蕉果肉总RNA提取条件优化

1.3.1RNA常规提取方法参照Asif等的方法[12]进行优化。首先将玻璃器皿、铁勺、研钵等清洗干净，然后用锡箔纸包裹，于180 ℃烘烤8 h以上，离心管等塑料制品均用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）水浸泡过夜，并于121℃高压灭菌 30 min，60 ℃烘干备用。具体操作如下：

（1）提取缓冲液[2% CTAB，100 mmol/L Tris-硼酸（pH值8.0），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（pH值8.0），2% PVP-K30]用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，将其预热至60 ℃；（2）果肉用液氮速冻后研磨成粉末，每0.2 g果肉加入1 mL提取缓冲液，涡旋混匀，于60 ℃放置30 min，每隔 5～10 min颠倒混匀1次；（3）将提取液冷却至室温，用等体积的三氯甲烷-异戊醇（24 ∶1）抽提，混匀，静置分层，室温下于 12 000 r/min 离心5 min；（4）取上清液，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇（24 ∶1）抽提，混匀，静置分层，室温、12 000 r/min 离心5 min；（5）在上清液中加10 mol/L LiCl至终浓度为 3 mol/L，-20 ℃放置4 h，4 ℃、12 000 r/min离心20 min；（6）小心倒掉上清，沉淀用0.5 mL 3 mol/L LiCl洗涤至少3次；（7）沉淀用0.3 mL DEPC处理水溶解，再用等体积的水饱和酚、三氯甲烷顺序抽提；（8）吸取上清液，加入1/15体积的 3 mol/L NaAc（pH值5.2）、1/5体积无水乙醇，冰上放置 0.5 h，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，沉淀多糖；（9）在上清液中加入1/10体积3 mol/L NaAc（pH值5.2）、3倍体积无水乙醇，于-70 ℃的冰箱沉淀2 h，4 ℃、12 000 r/min 离心 20 min，沉淀物用0.5 mL 75%乙醇洗涤2次，0.5 mL无水乙醇洗涤1次，每次都于12 000 r/min离心1 min，室温干燥后溶于RNase-free水中。endprint

1.3.2RNA提取条件优化考察提取缓冲液pH值、离子浓度、CaCl2浓度、处理温度、处理时间、LiCl沉淀时间对总RNA提取质量的影响，并用异丙醇简化RNA沉淀过程。

1.3.3RNA质量检测RNA纯度及含量检测：取1 μL RNA溶液，通过超微量分光光度计检测得到的RNA含量、D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值。纯RNA D260 nm/280 nm值应为1.8～2.2，D260 nm/230 nm值应为2.0～2.4。RNA回收率计算：RNA回收率（μg/g）=（D260 nm×40×原液体积）/提取样品质量（g）。

RNA完整性检测：用1.8%琼脂糖凝胶检测。完整的RNA电泳结果应是28S RNA与18S RNA亮度值比约为 2 ∶1，且这2条条带之间、条带上方和条带下方几乎没有弥散现象。

1.3.4RT-PCR分析选用NCBI上登录的香蕉MaActin1（GenBank登录号：AF285176）片段为内参，设计上、下游引物分别为MaActin1（5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′）、MaActin2（5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′）[22]。RNA逆转录合成cDNA第1链采用北京康为世纪生物科技有限公司的SuperRT cDNA第1链合成试剂盒。

PCR反应体系：12.5 μL 2×ES Master Mix，1 μL MaActin1（10 μmol/L），1 μL MaActin2（10 μmol/L），2 μL cDNA第1链，8.5 μL RNase-Free Water。反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。扩增结束后，取5 μL产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.5RNA提取方法验证将优化的RNA提取方法应用于香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮、黄香蕉果肉、黄香蕉果皮5种香蕉组织总RNA的提取，并进行RT-PCR分析。

2结果与分析

2.1缓冲液pH值、离子浓度对RNA提取质量的影响

针对香蕉组织富含酚类物质的特点，采用硼酸缓冲体系的RNA提取液，有利于去除组织中的酚类物质。其中的硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复合物，从而抑制酚类物质的氧化及它们与RNA的结合[23]。由表1可见，Tris-硼酸缓冲液pH值对香蕉果肉RNA质量、得率影响较大；Tris-硼酸缓冲液pH值为6、7、8、9时，D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合纯RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值，但RNA的得率差异较大；pH值为9时，得率最高，为18.14 μg/g。图1显示，Tris-硼酸缓冲液pH值为8、9时，28S RNA、18S RNA亮度比约为 2 ∶1，完整性较好。因此，选择缓冲液最优pH值为9。

由表2可见，Tris-硼酸缓冲液离子浓度为100、200、300 mmol/L 时，D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合纯RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；Tris-硼酸缓冲液离子浓度为 100 mmol/L 时，得率最高，为26.97 μg/g。图2显示，Tris-硼酸缓冲液离子浓度为100、200、300 mmol/L时，28S RNA、18S RNA 亮度比约为2 ∶1，完整性较好。因此，选择Tris-硼酸缓冲液离子浓度为100 mmol/L。

2.2CaCl2浓度、处理温度、处理时间对RNA提取质量的影响

钙离子在RNA提取过程中可以有效去除组织中的高分子果胶[24]。由表3可见，CaCl2浓度为0、50、100、150、200 mmol/L 时，提取的香蕉果肉RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合纯RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；不同CaCl2浓度所提取的RNA得率相差很小，当浓度为 150 mmol/L，得率最大，为32.44 μg/g；当不加CaCl2时，得率最低，为21.94 μg/g。图3显示，CaCl2浓度为0、100、200 mmol/L 时，28S RNA、18S RNA亮度比约为2 ∶1，完整性最好；CaCl2浓度为50、150 mol/L时，28S RNA ∶18S RNA小于 2 ∶1，完整性不好。综合考虑，选取CaCl2浓度为 100 mmol/L。

由表4可见，CaCl2加入后放置在0、25、60 ℃，所提取RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值均符合纯RNA的D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值；不同放置温度所提取的RNA得率相差很大，当放置在25 ℃时，得率最大，为20.57 μg/g。图4显示，CaCl2加入后放置在25、60 ℃，所提取RNA的28S RNA、18S RNA亮度比约为2 ∶1，完整性较好。所以，选择CaCl2加入后的放置温度为25 ℃。

3讨论与结论

针对青香蕉果肉组织富含果胶、多酚等次生物质，详细考察各因素对总RNA提取质量的影响，得出1种快速提取青香蕉果肉总RNA的方法，耗时约4 h，相比于传统氯化锂沉淀法（-20 ℃放置4 h或过夜放置），具有快速、操作简单、总RNA质量高等优点，该方法可用于黄香蕉果肉、黄香蕉果皮、香蕉花、青香蕉果肉、青香蕉果皮中总RNA的提取。从青香蕉果肉组织中提取的总RNA，可应用于香蕉多酚氧化酶的基因克隆研究中，笔者所在课题组已成功获得香蕉多酚氧化酶的基因[25]。

改良热硼酸法提取青香蕉果肉总RNA的优化提取方法：提取缓冲液内含2% CTAB、100 mmol/L Tris-硼酸（pH值 9.0）、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA（pH值8.0）、2% PVP-K30，用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，将其预热至60 ℃；组织用液氮速冻后研磨成粉末，每0.2 g果肉加入 1 mL 提取缓冲液，涡旋混匀，于60 ℃放置30 min，每隔5～10 min 颠倒混匀1次；向提取混合液中添加0.5 mol/L CaCl2，使其浓度为100 mmol/L，25 ℃放置20 min；冷至室温，用等体积的三氯甲烷、异戊醇（24 ∶1）抽提，混匀，静置分层，室温、12 000 r/min离心5 min；取上清液，加入等体积的三氯甲烷、异戊醇（24 ∶1）抽提，混匀，静置分层，室温、12 000 r/min离心5 min；上清液加入等体积的异丙醇，-20 ℃沉淀20 min，4 ℃、12 000 r/min离心20 min；小心倒掉上清，沉淀用0.5 mL 3mol/L LiCl洗涤至少3次；沉淀用0.3 mL DEPC水溶解，再用等体积的水饱和酚、三氯甲烷顺序抽提；吸取上清液，加入1/15体积的3 mol/L NaAc（pH值5.2）、1/5体积无水乙醇，冰上放置0.5 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min；在上清液中加1/10体积3 mol/L NaAc（pH值5.2）、3倍体积无水乙醇，在-70 ℃冰箱中沉淀2 h，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，沉淀物用0.5 mL 75%乙醇洗涤2次、0.5 mL无水乙醇洗涤1次，每次都于 12 000 r/min 离心1 min，室温干燥后将沉淀溶于RNase-free水中。endprint

参考文献：

[1]夏勇开. 中国香蕉生产技术的经济研究[D]. 海口：海南大学，2011.

[2]DHont D，Denoeud F，Aury J M，et al. The banana （Musa acuminata）genome and the evolution of monocotyledonous plants[J]. Nature，2012，488（7410）：213-217.

[3]柴娟，冯仁军，史后蕊，等. 一種快速提取香蕉叶片总核酸、总RNA和总DNA的新方法[J]. 热带作物学报，2014，35（1）：104-109.

[4]王尉，梁国鲁，谢江辉. 香蕉不同组织中总RNA提取方法的研究[J]. 西南师范大学学报（自然科学版），2007，32（1）：62-67.

[5]王甲水，张建斌，贾彩虹，等. 一种适合香蕉根系总RNA提取的方法[J]. 热带生物学报，2010，1（3）：202-205，209.

[6]冯斗，张春发，张颖. 一种适用于提取香蕉果肉RNA的方法[J]. 广西农业生物科学，2004，23（3）：249-251.

[7]刘海，林德球，徐杰，等. 一种适合于富含多糖和酚类物质的香蕉果实RNA提取方法[J]. 果树学报，2006，23（1）：136-137.

[8]Liu J J，Goh C J，Loh C S，et al. A method for isolation of total RNA from fruit tissues of banana[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1998，16（1）：87.

[9]淦国英，漆艳香，蒲金基，等. 改良CTAB法提取高质量香蕉叶片总RNA[J]. 广东农业科学，2009（7）：192-195.

[10]张妙霞，赖钟雄，赵巧阳. 野生香蕉叶片总RNA提取方法研究[J]. 中国农学通报，2009，25（14）：51-54.

[11]陈弟，殷晓敏，张荣意. 一种适合于提取香蕉果实总RNA的简便方法[J]. 广西热带农业，2008（2）：3-5.

[12]Asif M H，Dhawan P，Nath P. A simple procedure for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2000，18（2）：109-115.

[13]孙德权，郭启高，胡玉林，等. 改良Trizol法提取香蕉叶片总RNA[J]. 广东农业科学，2009（5）：162-164.

[14]李健. 蕉类果实中多酚含量及酚酶特性的研究[D]. 南宁：广西大学，2010.

[15]杨昭，王军，仇厚援，等. 青香蕉多酚氧化酶的提取工艺研究[J]. 广东农业科学，2014，41（7）：92-96，100.

[16]吴坤林. 香蕉的生物学特性及其组织培养技术[J]. 生物学通报，2006，41（10）：5-7，封四.

[17]李宏，王新力. 植物组织RNA提取的难点及对策[J]. 生物技术通报，1999（1）：36-39.

[18]张涛，韩梅，刘翠晶，等. 人参总RNA提取方法及反转录酶的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（8）：34-37.

[19]刘波，张晓明，郭巧生，等. 百蕊草根系总RNA提取方法比较及优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：44-46. [HJ1.71mm]

[20]Wan C Y，Wilkins T A. A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton （Gossypium hirsutum L.）[J]. Analytical Biochemistry，1994，223（1）：7-12.

[21]吴田，蓝增全. 茶梅花瓣总RNA提取方法的比较和分析[J]. 中国农学通报，2013，29（28）：129-133.

[22]张丽丽，徐碧玉，刘菊华，等. 香蕉谷胱甘肽过氧化物酶基因MaGPX的克隆和表达分析[J]. 园艺学报，2012，39（8）：1471-1481.

[23]武耀廷，刘进元. 一种高效提取棉花不同组织总RNA的热硼酸改良法[J]. 棉花学报，2004，16（2）：67-71.

[24]Dal C V，Danesin M，Rizzini F M，et al. RNA extraction from plant tissues the use of calcium to precipitate contaminating pectic sugars[J]. Molecular Biotechnology，2005，31（2）：113-119.

[25]陈娇，孙长君，杨昭，等. 香蕉多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达[J]. 热带作物学报，2015，36（12）：2198-2203.endprint