李建武　李灏德　文国宏

摘要：以2个马铃薯品种为材料，对AFLP反应过程中的关键因素（DNA浓度、酶切体系、扩增体系等）进行了优化，旨在建立适合马铃薯的EcoRⅠ/MseⅠ内切酶组合的AFLP反应体系和筛选扩增条带丰富的引物。结果发现，优化的马铃薯AFLP反应体系为37 ℃酶切4 h，37 ℃连接4 h，连接产物稀释10倍用于预扩增，预扩增产物稀释30倍用于选择性扩增。利用建立的优化反应体系，以10个甘肃省主栽马铃薯品种为材料，从256对引物组合中筛选出24对扩增条带多、条带清晰、多态性好的引物组合。

关键词：马铃薯；AFLP；体系建立与优化；引物筛选

中图分类号： S532.01文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0025-05

马铃薯作为甘肃省的第三大粮食作物，在全省农业和农村经济中占有重要的地位。作为马铃薯主产区，甘肃省马铃薯种植面积稳居全国第二，2014年种植面积70.8万hm2[1]，初步形成了高寒阴湿脱毒种薯繁育区、旱作雨养区中部高淀粉及菜用型、河西及沿黄灌区全粉及薯片（条）加工型、陇南天水早熟菜用型等四大优势生产区域。甘肃省开展马铃薯育种工作已有40多年，先后选育出陇薯系列、天薯系列、武薯系列、庄薯系列和甘农薯等40多个品种（系）[2]。

扩增片段长度多态性（amplified fragments length polymorphism，AFLP）技术是由荷兰科学家Vos等于1995年在RELP和RAPD基础上建立起来的一种选择性扩增酶切片段的方法[3-4]。AFLP具有多态性高、DNA用量少、结果稳定性好的优点，在水稻、大豆、小麦、马铃薯、甘蔗、棉花等作物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建、QTL定位研究、亲缘关系鉴定等研究中得到了广泛的应用[5-12]。

近年来，分子标记技术已经开始广泛应用到我国马铃薯种质资源的研究中，如应用SRAP技术开展了马铃薯遗传多态性研究[13-14]，利用SSR和AFLP技术开展马铃薯指纹图谱构建、遗传多样性、遗传图谱构建与QTL定位研究[15-20]。AFLP作为目前多态性最为丰富的标记，针对甘肃省主栽马铃薯品种和种质资源方面的研究还未见报道，本研究在前人所用方法的基础上优化了马铃薯AFLP反应体系，旨在为马铃薯遗传多样性研究、遗传图谱构建、种质资源鉴定等奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

以农业部西北旱作马铃薯科学观测实验站提供的马铃薯品种远杂18号和农天1号为材料，用于建立内切酶EcoRⅠ/MseⅠ组合AFLP反应体系；以甘肃省主栽的新大坪、陇薯5号、陇薯7号、陇薯8号、陇薯10号、庄薯3号、青薯9号、大西洋、费乌瑞它、LK99等10个马铃薯品种为材料筛选多态性较好的引物组合。

1.2试剂

本研究采用的基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ及T4 DNA连接酶均购自NEB（北京）有限公司；2×Taq Master Mix购自凌科生物科技（上海）有限公司；AFLP引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3基因组DNA的提取及质量检测

采用试剂盒法提取马铃薯DNA，取1 μL DNA样品混合上样缓冲液后在0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，以 DL2000 bp DNA Marker做对照，电泳缓冲液为1×TBE Buffer，电泳结束20 min后，取出凝胶放入浓度1 μg/mL的EB的电泳缓冲液染色15 min，取出凝胶后放置在美国Bio-rad伯乐Gel DocTM XR+成像系统观察拍照，确定提取的DNA质量和完整性。

1.4AFLP体系的建立

1.4.1酶切体系

酶切连接分2步进行。以远杂18号的基因组DNA为模板，使用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ组合对以上DNA样品进行双酶切。酶切体系为20 μL，包括10×Buffer（含BSA、ATP）2.0 μL，EcoRⅠ（20 U/μL） 0.1～0.2 μL，MseⅠ（10 U/μL） 0.2～0.4 μL，基因组DNA（100 ng/μL）3～6 μL，ddH2O 11.63～14.70 μL（表2），混匀后37 ℃水浴2～6 h。酶切结束后在68 ℃失活20 min， 酶切产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。期间对酶切反应体系中的限制性内切酶EcoRⅠ、MseⅠ浓度、基因组DNA浓度、酶切时间进行梯度优化。

1.4.2连接反应

连接反应液10 μL：5 μmol/L EcoRⅠ退火接头0.5 μL，50 μmol/L MseⅠ退火接头0.5 μL，T4 DNA连接酶（400 U/μL）0.5 μL，10×Buffer 1 μL，ddH2O 7.5 μL，室温下混匀，加入到10 μL酶切产物中，连接体系共20 μL，设4个处理，分别为37 ℃ 4 h，37 ℃过夜，16 ℃ 4 h，16 ℃过夜。连接反应结束后，65 ℃下反应10 min使连接酶失活，连接产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，其余在-20 ℃保存备用。

1.4.3预扩增优化将连接产物分别设置6个不同的稀释倍数（1×，5×，10×，15×，20×，30×）梯度，作为预扩增的模板，进行预扩增反应。预扩增反应体系20 μL，组分为酶切连接产物1.0 μL，2×Taq Master Mix预混液 10 μL，预扩增引物E-A（50 μmol/L）1.0 μL，预扩增引物M-C（50 μmol/L）1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。混匀离心后按以下程序扩增：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，22个循环；72 ℃ 10 min，10 ℃保存。预扩增产物在1.2%琼脂糖凝膠电泳检测，其余在-20 ℃保存用于选择性扩增。endprint

1.4.4选择性扩增优化

将预扩增产物设置6个不同的稀释倍数（10×，20×，30×，40×，50×，60×）梯度，作为选择性扩增模板，进行选择性扩增反应。选择性扩增反应体系 20 μL，组分为预扩增产物2.0 μL，2×Taq Master Mix预混液10 μL，选择性扩增引物E-nnn（50 μmol/L）1.0 μL，预扩增引物M-nnn（50 μmol/L）1.0 μL，ddH2O 6.0 μL，混匀离心后按以下程序扩增：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每个循环减低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，12个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23个循环；72 ℃ 5 min，10 ℃保存。选择性扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳

取10 μL选择性扩增产物，加入5 μL Loading Buffer，95 ℃ 变性5 min并迅速在冰浴中冷却后，在恒定功率 80 W、变性聚丙烯酰胺凝胶（60 mL凝胶母液，300 μL过硫酸铵，60 μL TEMED）中电泳90 min。

1.6银染及引物筛选

银染方法参照文献[21]，具体步骤：将凝胶放置在 1 500 mL 的固定液中（含10%乙醇，0.5%乙酸）固定5 min，转入含有 0.1% AgNO3与0.1% 甲醛的染色中染色6 min；蒸馏水漂洗2 s；立即放入含1% NaOH与0.2%甲醛的显影液中轻轻摇晃显影至条带清晰。

2结果与分析

2.1基因组DNA提取

AFLP标记对DNA的纯度及完整性要求较高，为了确保参试材料的基因组DNA纯度和完整性，本研究采取试剂盒法提取了12份马铃薯材料的基因组DNA。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1）表明，基因组DNA浓度较低，无拖尾现象，残留杂质少且完整性好，在纯度上完全能够满足AFLP分析的要求。

2.2AFLP体系优化

2.2.1酶切反应

以品种远杂18号的基因组DNA为材料，使用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ在37 ℃进行双酶切反应 4 h，对限制性内切酶量与DNA浓度进行梯度筛选。酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图2）表明，不同限制性内切酶浓度对基因组DNA经限制性内切酶消化后片段大小集中在100～1 000 bp之间，弥散带分布均匀，表明酶切彻底，符合AFLP对酶切效果的要求，其中当EcoRⅠ、MseⅠ分别为0.125、0.25 μL时，DNA浓度400～600 ng可满足酶切效果，确定EcoRⅠ（20 U/μL）0.125 μL、MseⅠ（10 U/μL）0.25 μL、DNA（100 ng/μL）5 μL为酶切体系的反应浓度。

以远杂18号基因组DNA为材料，将20 μL酶切体系[EcoRⅠ（20 U/μL）0.125 μL，MseⅠ（10 U/μL）0.25 μL，DNA（100 ng/μL）5 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 12.63 μL]放置在37 ℃下，设置2、3、4、5、6 h等5个梯度下筛选酶切反应时间，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3）表明，酶切3～5 h，产物弥散带分布均匀，且条带亮度较高，表明酶切产物丰富，符合AFLP对酶切效果的要求，确定4 h为适宜的酶切时间。

2.2.2连接反应

经EcoRⅠ 2.5 U和MseⅠ2.5 U对500 ng DNA在37 ℃下酶切4 h的产物为模板，在10 μL酶切体系中加入10 μL连接反应液，连接体系共20 μL，经不同温度和时间连接反应后，65 ℃下10 min使连接酶失活，连接产物在 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，4个处理的连接产物均为弥散状，片段主要集中在100～1 000 bp，符合AFLP反应要求，37 ℃连接4 h和过夜后片段浓度较低，亮度低，16 ℃连接4 h和过夜后，片段亮度高，连接效果较好，从缩短试验周期、节约时间角度考虑，确定酶切连接温度为37 ℃，时间为4 h（图4）。

2.2.3预扩增优化

预扩增以远杂18号基因组DNA的酶切连接产物为模板，连接产物稀释倍数分别为1、5、10、15、20、30倍，同时以农天1号基因组DNA的酶切连接产物为重复。预扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图5、图6）表明，不同稀释倍数的模板即模板浓度对预扩增效果并无明显影响，不稀释时条带集中在500 bp附近，稀释20倍和30倍的模板扩增的条带不清晰，稀释10倍和15倍时条带清晰，因此选择稀释10倍为最佳稀释倍数。

2.2.3选择性扩增优化

选择性扩增以远杂18号基因组DNA预扩增产物为模板，预扩增产物稀释倍数分别为10、20、30、40、50、60倍，同时以农天1号基因组DNA的预扩增产物为重复。预扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图7、图8）表明，不同稀释倍数的模板即模板浓度对预扩增效果并无明显影响，选择性扩增片段介于100～500 bp之间，均符合AFLP分析要求，稀释10倍、20倍和40倍时的模板选择性扩增的条带不清晰，预扩增产物稀释30倍、50倍和60倍时条带清晰，因此选择稀释30倍为最佳稀释倍数。

2.3最佳AFLP体系的确定与引物筛选

为了验证所建立的马铃薯AFLP反应体系是否稳定，能否在各引物组合间普遍使用，试验以品种陇薯7号材料所建立的体系，对12个甘肃省主栽马铃薯品种对限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ的引物256对组合进行了初步筛选。结果得到多态性均在5个以上的引物组合70对，多态性位点在8个以上的引物组合24对，分别为E-ACT/M-CGC、E-ACA/M-CCT、E-ACA/M-CCC、E-ACA/M-CCA、[JP2]E-ACA/M-CAT、E-ACA/M-CAG、E-ACA/M-CAC，E-AAC/M-CCG、E-AAC/M-CGC、E-ATG/M-CGT、E-ATG/M-CGC、E-ATA/M-CGT、E-ATA/M-CGG、E-AGG/M-CGA、E-AGG/M-CCG、E-AGG/M-CCA、E-AGG/M-CAT、E-AGC/M-CAT、E-AGC/M-CAA、E-ATT/M-CCG、E-AAG/M-CGG、E-ACG/M-CCC、E-ACA/M-CCG、E-ATT/M-CGA（圖9）。endprint

3讨论

AFLP标记技术操作流程复杂，涉及到的步骤多、影响因素繁多，在实际的应用过程中容易出现问题，导致整个试验的失败。因此，在DNA提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、凝胶电泳和银染分析的每个环节都必须满足技术要求，才能得到最佳结果。

高质量的DNA是AFLP标记分析成功的关键。完整的基因组DNA能保证在后续的试验中获得整个基因组的多态性信息；高纯度的DNA能保证限制性内切酶酶切充分完全。本研究采用试剂盒法提取的马铃薯基因组DNA纯度较高、完整性较好，符合AFLP标记酶切反应对DNA质量的要求。

酶切过程是AFLP标记分析成功关键环节。酶切时间受到植物样本的基因组大小、序列以及所含的次生代谢产物影响[22]。本研究在37 ℃下设置了5个时间处理，酶切时间过短时，基因组DNA酶切不完全，没有产生丰富的片段，不能真实地反映整个基因组信息；酶切5、6 h酶切效果与4 h的无明显差异，最终确定酶切时间为4 h，既能保证酶切完全充分，也降低了酶切过量的可能性。

酶切后的DNA片段和接头连接后，酶切位点侧翼的保护性序列就发生了改变，内切酶EcoRⅠ和MseⅠ就不能识别酶切位点[23]。酶切产物连接要充分，連接时间过短，人工接头与酶切片段不能完全连接上，会造成预扩增产物中缺少目的片段而使试验失败，本研究确定在37 ℃连接4 h。

预扩增反应在AFLP的整个反应体系起到承上启下的作用。酶切和连接成功与否，只能通过预扩增进行判断，预扩增不仅可以作为酶切和连接反应是否完全充分的标志，而且还直接影响到选择性扩增的结果，只有到预扩增能产生稳定的片段，才能说明连接反应成功且预扩增体系稳定。本研究将连接产物稀释10倍时预扩增产物产生较为稳定的弥散带，大小介于100～1 000 bp之间，且稳定性好，不需要对预扩增体系进一步优化。预扩增产物的稀释倍数对于选择性扩增的成败非常重要，稀释倍数太大导致带型模糊，难以辨别；稀释倍数太小显带很弱或显不出带，不利于条带的读取及多态性片断的检出。本研究将预扩增产物稀释30倍时，选择性扩增结果较好，带型清晰，稳定性好，便于读带和统计。

4结论

本研究选用限制性内切酶EcoRⅠ/MseⅠ组合建立了马铃薯AFLP的最佳反应体系，即采用试剂盒法提取DNA，37 ℃ 酶切4 h，37 ℃连接4 h，连接产物稀释10倍，预扩增产物稀释30倍作为选择性扩增的模板。通过建立的AFLP体系从256对引物组合中筛选出了24对扩增条带清晰、多态性好的引物组合。

[HS2*3]参考文献：

[1]赵婧，赵贵宾，李星，等. 甘肃省推进马铃薯主粮化行动的几点思考[J]. 中国马铃薯，2015，29（3）：182-185.

[2]杨祁峰，岳云，熊春蓉，等. 甘肃省马铃薯产业发展现状及思考[C]//2014年中国马铃薯大会论文集. 哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2014：138-143.

[3]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al. AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research，1995，23（21）：4407-4414.

[4]Vantoai T T，Martin S S. Using AFLP markers to determine the genomic contribution of parents to populations[J]. Crop Science，1997，37（4）：1370-1373.

[5]张春庆，贾继增. 水稻AFLP指纹图谱的引物选择研究[J]. 中国农业科学，2002，35（7）：733-737.

[6]田松杰，石云素，宋燕春，等. 利用AFLP技术研究玉米及其野生近缘种的遗传关系[J]. 作物学报，2004，30（4）：354-359.

[7]王立新，常利芳，黄岚，等. 小麦AFLP片段序列多态性分析和AFLP-SCAR标记的研究[J]. 麦类作物学报，2007，27（6）：943-951.

[8]秦伟伟，李永祥，李春辉，等. 基于高密度遗传图谱的玉米籽粒性状QTL定位[J]. 作物学报，2015，41（10）：1510-1518.

[9]李芳弟，王舰，王芳，等. 马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选[J]. 分子植物育种，2010（1）：179-185.

[10]王志伟，魏利民，谢晓美，等. 利用AFLP构建棉花遗传图谱及纤维品质性状QTL分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（7）：71-74.

[11]昝逢刚，应雄美，吴才文，等. 98份甘蔗种质资源遗传多样性的AFLP分析[J]. 中国农业科学，2015，48（5）：1002-1010.

[12]高帆，宋餠. 基于AFLP标记的苦荞种质资源遗传多样性研究[J]. 江苏农业科学，2016，44（5）：122-126.

[13]何凤发，杨志平，张正圣，等. 马铃薯遗传资源多样性的SRAP分析[J]. 农业生物技术学报，2007，15（6）：1001-1005.

[14]赵光磊，张雅奎，吴凌娟，等. 黑龙江省主栽马铃薯品种遗传多样性的SRAP分析[J]. 西北农业学报，2015，24（2）：1-13.

[15]段艳凤，刘杰，卞春松，等. 中国88个马铃薯审定品种SSR指纹图谱构建与遗传多样性分析[J]. 作物学报，2009，35（8）：1451-1457.

[16]单友蛟，刘杰，卞春松，等. 马铃薯SSR遗传连锁图谱构建及3个重要农艺性状QTLs定位[J]. 中国蔬菜，2010（18）：10-14.

[17]石景，宋波涛，金开建，等. SSR标记的彩色马铃薯遗传多样性分析及指纹图谱构建[J]. 农业生物技术学报，2012，20（4）：362-371.

[18]Wang H X，Walla J A，Magnusson V A，et al. Construction of genetic linkage maps and QTL mapping for X-disease resistance in tetraploid chokecherry （Prunus virginiana L.） using SSR and AFLP markers[J]. Molecular Breeding，2014，34（1）：143-157.

[19]Dhoop B B，Keizer P L，Paulo M J，et al. Identification of agronomically important QTL in tetraploid potato cultivars using a marker-trait association analysis[J]. Theoretical and Applied Genetics，2014，127（3）：731-748.

[20][JP3]Khan M A，Saravia D，Munive S，et al. Multiple QTLs linked to agro-morphological and physiological traits related to drought tolerance in potato[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2015，33（5）：1286-1298.

[21]李建武，李宁. SSR标记变性聚丙烯酰胺凝胶快速银染方法的建立[J]. 中国马铃薯，2015，29（3）：136-140.

[22]孙凤梅，沈晓霞，沈宇峰，等. 薏苡AFLP体系的建立与优化[J]. 浙江农业学报，2014，26（1）：1-19.

[23]周延清. DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M]. 北京：化学工业出版社，2005.[HT]endprint