李贝贝　刘崇怀　姜建福

摘要：品种鉴定是葡萄种质资源保存、研究、开发利用以及新品种品种权保护的重要依据。随着分子生物学技术的深入发展，出现了多种基于DNA水平的分子标记技术用于品种鉴定。本文综述了目前国内外几种主要的分子标记技术（AFLP、RAPD、SSR、ISSR、SRAP、SNP、iPBS）在葡萄品种鉴定中的应用与研究进展，并阐述了各种标记方法的基本原理和特点，以期为今后葡萄品种鉴定提供参考依据。

关键词：葡萄；分子标记；品种鉴定；研究进展；基本原理；特点

中图分类号：S663.101 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0015-06

葡萄为葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis L.）植物，是世界范围内栽培最广泛的树种之一，目前世界已经报道的葡萄品种有6 000～10 000个[1]。在葡萄的生产过程中，优良品种是提高葡萄质量和种植效益的必要条件，也是其产业持续发展的重要保障，回顾我国葡萄产业的发展历程，每一个快速发展时期都伴随着新品种的引进、选育与推广，新品种对促进葡萄产业的发展发挥着越来越重要的作用[2]。

葡萄多为无性繁殖，扦插繁殖容易，不同地区之间品种交流频繁，导致其种类和品种繁多，同名异物及同物异名现象严重[3]。另外，由于国内现阶段的种苗市场管理还不完善，部分不法苗木商为了自身利益，导致市场上以劣充优、以假乱真现象时有发生[4]。因此，为了保护育种者的权益及保证葡萄产业健康发展，对葡萄品种进行快速、准确可靠的鉴定显得尤为重要。同时，随着我国加入世贸组织和国际植物新品种保护联盟后，一个新品种的推广、产权保护都必须提供该品种特异的鉴定标记[5]。而传统的品种鉴定都以形态学标记为主，该方法易受环境及季节的影响，且鉴定时间长、工作量大。此外，由于新品种选育技术的同质化，品种之间的形态差异也越来越小，目测区分植株性状就显得越来越困难。

近年来，随着分子生物学技术的发展与成熟，使根据遗传物质DNA在不同生物个体之间的差异来鉴别生物物种成为可能，并且取得了显著成果。分子标记技术是一种以DNA多态性为基础，通过检测DNA分子由于缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生多态性的技术[6]，该技术不受环境因素及发育阶段的影响，具有快速、简单、准确、可靠、稳定、经济等特点。国际植物品种权保护联盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，簡称UPOV）也将DNA分子标记鉴定作为农作物品种DUS（distinctness uniformity and stability）测试的辅助手段[7]。已经发展起来的分子标记多达60多种，应用较广的主要有AFLP、RAPD、SSR、ISSR、SRAP、SNP以及iPBS等。目前，DNA分子标记鉴定技术已在多种作物上开展了广泛的研究，在葡萄品种的鉴定方面取得了很大的进展，本文对目前国内外7种主要的分子标记技术原理以及在葡萄品种鉴定上的应用进展作一综述，以期为今后葡萄品种鉴定技术的选择提供参考依据。

1国内外葡萄品种的鉴定技术

1.1RAPD技术

随机扩增多态DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分子标记发展于1990年[8-9]，它是以基因组DNA为模板，利用人工合成的单链随机引物（一般8～10 bp）对其进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增片段，从而得到多态性标记的一种技术。RAPD标记简便、快速、成本低，无须了解基因组序列信息，DNA用量少，基于以上优点，被广泛应用于种质资源鉴定及遗传关系分析等方面[10-14]。

1997年，Stavrakakis利用15个RAPD标记鉴别了8个希腊品种，结果表明，RAPD标记技术适合用于葡萄品种鉴定[15]。王军等利用RAPD标记技术分别分析了中国野生葡萄和鲜食葡萄，认为RAPD标记技术可有效区分葡萄种质，是一种快速、经济实用的分子标记技术[16-17]。Bajraktari等以Rahovec的6个主栽品种为材料，利用10对高效的RAPD引物对其进行鉴定分析，鉴定结果与形态学检测的结果完全一致，6份种质均被区分开，排除了同名异物的存在[18]。2008年，李玉霞等依据RAPD技术对蛇龙珠葡萄的来源和亲缘关系进行了分析，认为蛇龙珠可能为法国的嘎赫姆奈赫，而非以前被认为的品丽珠[19]。随后，2012年李红娟等利用RAPD分子标记对8个蛇龙珠营养系进行遗传多样性分析，并将其与赤霞珠和品丽珠之间的亲缘关系进行验证，结果显示蛇龙珠的5个营养系之间没有任何差别，其余3个营养系之间却存在一定的差别，提出了蛇龙珠在遗传基础上与品丽珠有一定的差异，应属不同品种[20]。Zhao等用基于RAPD标记的MCID法完成了对葡萄品种的鉴定，该方法对将来葡萄品种鉴定以及新品种权保护具有重要意义[21-23]。El-Sayed等仅用1对RAPD引物就将Thompson Seedless、Red Roomy、Palomino、Rish Baba、Ruby Seedless、Beauty Seedless、Superior和Flame Seedless等8个葡萄品种区分开，再次证明了RAPD标记鉴定葡萄品种的可行性[24]。另外，RAPD标记还可用于区分芽变品种，如张国海成功地应用RAPD分子标记鉴定了巨峰及其芽变品种98-2、京亚及其芽变品种洛浦早生[25]。RAPD分子标记以其独特的优势在20世纪90年代前期得到了广泛的应用，但在实际应用中也存在一定的缺陷，其稳定性和重复性较差，这主要是因为该种标记是显性标记，不能区别纯合体和杂合体。

1.2AFLP技术

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记是由荷兰科学家Zabeau等发明的一种分子标记技术[26-27]。其基本原理是利用成对的限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，酶切片段与人工接头（与酶切片段含有共同黏末端）连接，并通过引物（引物由接头，酶切位点和2～3个核苷酸组成）扩增得到大量DNA片段，最后通过聚丙烯酰氨凝胶电泳对扩增片段多态性进行检测。AFLP技术结合了RFLP与RAPD等2种分子标记技术的优点，既有前者的可靠性，又有后者的灵敏性。endprint

AFLP技术以其重复性好、多态性高、分辨率高等优势常被用于葡萄无性系变异或突变品种的鉴定[28-29]。该技术可以解决同工酶标记、形态学、生物化学等不能解决的问题。Scott等成功地应用AFLP技术鉴定了火焰无核及其早熟突变体，这也是首次利用AFLP标记成功鉴定突变体[30]。Cervera等利用AFLP分子标记技术对35个鲜食品种及2个Napoleon无性系变异品种（N10-7、N76-7）进行鉴定，分别使用2个引物组合[2E（+ACC，+ACT）/M+CAT，2E（+ACC，+ACT）/M+CTG]和1个引物组合[2E（+ACC，+ACT）/M+CTT]将鲜食品种和无性系变异品种区分开，结果表明，AFLP技术是鉴定无性系变异品种的一种有效方法[31]。超藤葡萄是藤稔的芽变品种，二者亲缘关系十分接近，鲍露等应用传统的形态标记以及RAPD分子标记不易将其区分开，而利用AFLP标记成功地将其区分开，这突显了AFLP标记的重复性强、多态性丰富的优点[32]。2011年，Vlba等采用SSR标记与AFLP标记成功地鉴别开一对同物异名品种（Glianico Nero与Aglianico del Vulture Nero），而早在2001年Costacurta已提出了这样的猜测，Vlba等对其进行了验证，认为AFLP是区分同名异物或同物异名品种的有效方法[33]。无性系筛选是葡萄品种改良的重要方法，近年来育种家在无性系筛选方面也做了很多工作，Manjari Naveen是依据形态学筛选出的一个无核白鸡心的无性系变异品种，2013年Shinde等对Manjari Naveen与无核白鸡心的DNA进行了AFLP分析，结果显示Manjari Naveen与无核白鸡心为2个不同的品种[34]。虽然AFLP分子标记稳定性好、准确性高、能有效区分亲缘关系较近的品种，但其对DNA质量要求较高，并且操作复杂、成本较高。

1.3ISSR技术

简单重复间序列（inter simple sequence repeat，ISSR）是基于微卫星标记（SSR）发展而来的一种分子标记，由Zietkiewicz等于1994年提出[35]。[JP2]它是在微卫星序列的3′端或5′端锚定2～4个核苷酸，以其为引物对SSR之间的DNA片段进行扩增。ISSR技术即利用了丰富的SSR序列信息，同时又克服了RFLP技术的局限性和RAPD的假阳性[36]，以其简单迅速、多态性丰富、稳定高效等特点被广泛应用于品种鉴定、亲缘关系鉴定、遗传多样性分析以及遗传图谱构建等方面。[JP]

Argade等以印度的43份无籽葡萄品种（欧亚种）为材料，利用ISSR分子标记方法对其进行鉴定，筛选出的14个多态性引物能够准确地将样本区分开，其中有3对ISSR引物（UBC857、888和890）能将该42个无籽葡萄品种全部清楚地区分开[37]。Hassan等依据表型、ISSR标记对3份埃及葡萄品种进行分析，经UPGMA软件聚类发现Red Romy与Matrouh亲缘关系较近，与Bez E1-anza较远，认为ISSR标记适合于葡萄品种鉴定[38]。2014年，Choudhary等用ISSR分子标记技术，采用10对ISSR引物对Nanasaheb purple、Sonaka、Thompson seedless和Ganesh的遗传变异进行了分析，再次证明ISSR标记用于葡萄品种鉴定的可行性[39]。钱春等利用ISSR分子标记方法分别鉴定了白香蕉及其芽变品种和巨峰及其芽变株系，结果表明，ISSR标记能有效用于芽变鉴定[40-41]。李继洋等对新疆19份葡萄品种的DNA进行了ISSR分析，建立了14个葡萄品种的DNA指纹图谱，为葡萄品种的快速鉴定奠定了基础[42]。张永辉等应用ISSR技术分析了81份葡萄品种的遗传关系，根据聚类结果，将误定为毛葡萄的毛葡萄1099确定为桑叶葡萄，并确定福建野葡萄和华东葡萄1058属于同物异名材料[43]。张娜以新疆的137份葡萄种质为试验材料，采用ISSR标记对其遗传多样性进行了分析，根据聚类结果得知新疆本地葡萄品种并非野生种，而是由欧亚种演变而来的[44]。综上所述，ISSR技术适合用于葡萄品种鉴定，但ISSR也存在一定的缺点，即其只是部分共显性，不能有效区分检测位点的纯合与杂合。

1.4SRAP技术

相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）发展于2001年，由美国加州大学的Li等提出[45]。其原理是利用设计的引物对开放阅读框（open reading frames，ORFs）进行扩增[46]，正向引物对外显子进行扩增，反向引物对内含子和启动子区域进行扩增，由于不同物种以及个体间的内含子、启动子和间隔序列存在很大的变异，从而扩增出多态性片段。SRAP分子标记技术具有操作简单、可靠性好、重复性好等特点，且优于AFLP、ISSR和RAPD，在种质资源遗传多样性分析以及品种鉴定上得到广泛应用。

苑炜建立了适于葡萄SRAP分析的技術体系，应用SRAP分析标记评价了156份葡萄种质的亲缘关系及遗传多样性水平[47]。Guo等利用19对SRAP引物区分开了包括欧亚种、欧美杂种、中国野生种在内的76份葡萄种质，其中包含洛浦早生与京亚、98-1与绯红、98-2与巨峰，表明SRAP也可鉴定芽变品种[48]。Liu等以中国野生葡萄为试验材料，应用SRAP技术对其遗传多样性进行了分析，在遗传相似系数为0.84处可清楚地区分开所有品种，聚类结果也验证了桑叶葡萄是毛葡萄的亚种[49]。张旭彤等也利用SRAP标记技术对中国野生葡萄进行了研究，进一步证明了SRAP标记鉴定葡萄品种的可行性[50-53]。但是，SRAP标记也存在一定的限制，其没有通用的退火温度，研究者需要对不同植物材料的退火温度进行摸索，从而延长了SRAP标记的试验周期，且SRAP是针对ORFs区域进行扩增，对基因组的扩增范围有限。endprint

1.5SNP技术

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分子标记是在1996年由Lander提出的第3代DNA遗传标记[54]，是指基因组DNA序列上单个碱基的变异所引起的DNA序列多态性，这种变异是由单个碱基的转换、颠换所致。SNP标记是用于检测种内个体间遗传变异的分子单位最小的技术，稳定性好、数量巨大且分布广泛，其多样性是目前所有分子标记中最丰富的一种。目前SNP已广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定等方面。

Dong等设计9对SNP引物成功地区分开了16个葡萄品种，结果证实SNP标记可用于葡萄品种鉴定以及遗传多样性分析[55]。Riahi等利用73个SNP标记对44份突尼斯葡萄品种的[WTBX][STBX]VvmybA1基因、VvmybA2[WTBZ][STBZ]基因进行分析，研究品种之间的亲缘关系及遗传多样性，结果分别用27个SNP标记和22个SNP标记区分开了22份突尼斯栽培种以及22份突尼斯野生种，认为开发的2套SNP标记对今后的品种鉴定有巨大的帮助[56]。Ghaffari等同样也以突尼斯葡萄品种为试验材料，采用SNP分子标记技术对其中的29份野生种与28份栽培种的亲缘关系进行了分析，结果表明，突尼斯的野生种并非是当地品种，可能来自其他地区，同时发现2个错误命名品种（Turki与Reine de Vignes）[57]。Cabezas等通过对挑选出的11个样本进行重测序并获得了300多个SNP标记，对其进行分析后最终筛选出48个均匀分布于葡萄19条染色体上的具有高分辨率的SNP标记，将其作为葡萄基因分型的一套标准，并利用该标准成功鉴定了来自世界各地的一组葡萄品种，充分证明SNP分子标记技术的可靠性及稳定性[58]。所有这些研究都证实了SNP分子标记可以用于葡萄品种的鉴定。但是用于检测SNP的DNA芯片设计成本高，且由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检测到。

1.6SSR技术

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）别称微卫星DNA（microsatellite DNA），由Moore等于1991年创立[59]，是一类由1～6个碱基为重复单元组成的简单串联重复序列。这些简单重复序列均匀、随机、广泛地分布于真核生物的基因组上，具有丰富的多态性。其基本原理是根据SSR两端的保守互补序列设计1对特异引物，利用PCR对其进行扩增，因重复单元的次数不同，扩增片段长度就产生了差异，从而体现出SSR座位上的多态性。SSR分子标记具有标记数量多、多态性高、信息量高、试验稳定性和重复性强、操作简单方便、对DNA质量要求低、呈共显性遗传等独特优势，已经成为目前分子标记技术的热点，在国内外得到了广泛的应用。

Thomas等相继在1993、1996、1999年报道了VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD32、VVMD28、VVMD27、VVMD25[60-62]等7个适合葡萄品种鉴定的SSR引物。1999年，Sefc等为了丰富SSR标记多态性，又开发了2对SSR引物VrZAG79和VrZAG62[63]。因该9对引物均匀分布于葡萄19条染色体上且具有高的多态性而被国外视为通用引物，并且法国、意大利、德国、瑞士、美国等国研究者利用该9对引物构建了数据库。2006年Kiss等利用SSR分子标记方法构建了109个葡萄品种的SSR指纹图谱，可以方便其他研究者利用该指纹图谱进行品种鉴定[64]。韩国研究者Cho等利用SSR-PCR标记技术对30个葡萄品种进行了鉴定，研究表明Jinok与康拜尔早生相似系数为1，可能为同一品种，同时仅用3对SSR引物（VVIt60、VVIn61、VVIu20）就将剩余的28份种质区分开[65]。Durán等采用SSR技术从分子水平上分析了阿根廷品种Pedro Giménez和西班牙品种Pedro Ximénez的差异，证明了两者并非是同一品种，并认为Pedro Giménez是Muscat of Alexandria和Criolla Chica的后代[66]。Jahnke等依据SSR分子标记技术完成了砧木品种的分析鉴定[67]。2015年Mihaljevic等以克罗地亚和黑山的284个地方品种为试验材料，利用9对SSR引物对其进行遗传多样性分析，结果检测出25个之前未曾报道过的基因型，并将得到的数据与欧洲数据库以及其他已报道的相关研究结果进行比对，发现了一些新的同名异物和同物异名品种[68]。SSR分子标记还可用于亲本鉴定[69]、无性系鉴定[70-71]以及同物异名和同名异物品种的鉴定[72-74]。目前国内也开展了SSR标记鉴定葡萄品种的研究，例如樊秀彩等以山葡萄、河岸葡萄以及239株二者的杂交后代为材料，从12对SSR引物中筛选出7对能扩增出父本特异条带的引物，作为杂种鉴定的标记，利用该7对特异引物对供试材料进行快速鉴定，结果表明，杂交后代中有161株被确认为真杂种，认为SSR标记可有效地对葡萄属种间杂种进行鉴定[75]。杜晶晶应用9对SSR引物鉴别了80份葡萄种质，并构建了80份葡萄种质的有效分子身份证[76]。李慧等利用SSR标记和IRAP标记对关口葡萄的亲缘关系进行了分析，结果表明关口葡萄属于欧美杂交种，既不是尼加拉也不是白香蕉[77]。成冰等对13个酿酒白葡萄品种进行了SSR分析与鉴定，研究表明引物VrZAG62和VVIb66都可以将这13个酿酒白葡萄品种区分开[78]。宪立杰等对取自中国农业科学院郑州果树研究所葡萄资源圃的45份葡萄种质进行了SSR分析，利用19对核心引物扩增出76條带，其中74条具有多态性，并利用SSR标记初步建立了一个SSR基因型指纹库，为鉴定葡萄品种或品系提供了基础数据[79]。郭春苗等以新疆44个适宜制干葡萄品种为试材，从52对引物中筛选出8对多态性高的引物并对其进行SSR分析，利用4条引物构建了品种DNA指纹图谱，通过统计测验可将44份葡萄种质区分开来，认为SSR分子标记技术可准确地鉴定葡萄品种[80]。李雪雁等以75个葡萄栽培品种为材料，选用19对核心SSR引物对其进行研究，建立了一套适合于葡萄DNA指纹图谱构建的技术体系，为葡萄种质资源的鉴定提供了依据[81]。尹玲等对我国新育成的24份葡萄种质进行了SSR分析，结果表明，所用的6对SSR引物可以明确地区分开供试葡萄品种，还能正确地鉴定出品种的倍性，并建立了24份葡萄品种的SSR指纹图谱，为品种鉴定、亲缘关系分析以及植物品种权保护提供参考依据[82]。研究者普遍认为，SSR分子标记具有高的多态性，非常适用于葡萄品种鉴定和DNA指纹图谱的构建。endprint

1.7iPBS技术

引物结合位點间扩增（inter primer binding site，iPBS）标记是一种新型、简单、快速、高效的分子标记方法，该技术由Kalendar等在2010年建立[83]。它是以长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）类反转录转座子保守位点设计引物对该类反转录转座子中2个引物结合位点（PBS）区间进行扩增的一种分子标记技术，与早期基于反转录转座子的分子标记方法不同，不须要预先获知LTR的序列。iPBS标记技术是葡萄种质资源遗传多样性分析及鉴定的一种新的技术手段。近些年，iPBS标记在杏[84]、杨梅[85]、雪莲果[86]、虎杖[87]、牡丹[88]等植物上都有所研究。

2014年张潇玉等以巨峰葡萄为试材，iPBS引物2249为扩增引物，对葡萄iPBS-PCR反应体系的各个成分以及退火温度进行优化，利用优化后的iPBS-PCR反应体系对18份葡萄种质进行扩增检测，获得的条带清晰、稳定且多态性高，为葡萄种质资源鉴定及遗传多样性评价提供了重要的技术支持[89]。Guo等对35份葡萄种质进行了iPBS分析，利用15对iPBS引物扩增出99条DNA谱带，其中86.3%具有多态性，由软件UPGMA进行聚类，结果表明葡萄栽培种和野生种存在明显的差异，且拥有丰富的遗传多样性[90]。iPBS也存在自身的限制，其对模板DNA纯度和片段大小要求较高。iPBS作为一种刚发展起来的新型分子标记，在葡萄品种鉴定上的应用刚起步。

2小结与展望

葡萄品种的鉴定方法从最初的形态学鉴定发展到同工酶鉴定，再到现在常用的分子标记鉴定，经历了从形态学到分子生物学，从外部到内部的过程。传统的形态学标记及同工酶鉴定易受环境因素的影响，同时也受不同发育时期的限制。而分子标记则不存在上述问题，它是从分子的角度展示了不同品种间存在的差异。本文所介绍的几种DNA分子标记技术在葡萄品种鉴定应用中各有优缺点，在鉴定一些不易区分的亲缘关系较近的品种或芽变品种时，可将几种分子标记方法相结合以达到最终目标。DNA分子标记的发展是永无止境的，今后不仅要加速开发新型的DNA指纹技术，还要对现有DNA分子标记技术加以改进，建立快速鉴定葡萄品种的方法体系，从而实现品种鉴定的简单化、自动化。

随着分子生物学技术的发展，以DNA分子标记为基础的指纹图谱构建逐渐成为热点，因其具有准确可靠、简便快速、易于自动化等优点已成为品种鉴定的重要技术手段。国际植物品种权保护保护联盟（UPOV）在BMT测试指南草案中已经将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR和SNP[4]，SSR标记以其独特的优势，成为当前构建指纹图库以及品种鉴定的首选标记。随着生物技术和互联网信息技术的发展壮大，构建品种DNA指纹数据库和全国统一查询平台势在必行。可以在利用形态学鉴定品种的同时，通过筛选适合葡萄品种鉴定的核心引物，建立现有葡萄品种的DNA指纹数据库，并利用计算机技术将该指纹数据库与对应品种的形态学数据相结合建立一个平台，从而实现快速鉴定葡萄品种的目的。该平台的建立可以使试验数据在不同实验室得到共享，可有效保护葡萄育成品种的知识产权和育种者的权益，保证葡萄产业健康可持续发展。

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