何佳鑫 赵 晖 张秋霞 齐 放 李君玲 张 楠 樊永平 李 明△ 王 蕾△

（1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100050）

多发性硬化（MS）是一种以炎症反应、轴突及神经元的损伤为主要病理特征的中枢神经系统（CNS）脱髓鞘疾病［1］，易反复发作，且致残率较高。轴突修复和再生是改善该病病情及恢复患者神经功能的治疗要点之一［2］。中枢神经损伤后会立即启动一系列和形成瘢痕组织相关的细胞及分子间的反应。胶质瘢痕中生成大量的神经生长抑制因子，破坏神经再生微环境，是导致轴突再生修复困难的重要原因［3］。硫酸软骨素糖蛋白（CSPGs）是神经系统细胞外基质成分中的一类蛋白多糖，由星形胶质细胞和少突胶质细胞神经元分泌，在损伤区堆积，是瘢痕组织中影响神经再生的最主要的抑制因子［4］。星形胶质细胞是胶质瘢痕的主要组成部分，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为星形胶质细胞的中间丝骨架蛋白，GFAP增强可提示星形胶质细胞活化或反应性胶质增生，是胶质瘢痕的重要标志物［5］。目前西医主要采用免疫抑制和调节的方法治疗，对MS有一定的疗效，但长期大量应用副作用大［6］，对神经再生无安全有效的方法。樊永平教授通过长期临床实践，根据MS肾虚兼痰瘀的基本病机，在补肾化痰活血治法的指导下，创立了补肾益髓方［7］。大量临床研究表明本方能够改善MS患者神经症状，减少其复发，提高了患者生存质量［8］。笔者的前期研究显示补肾益髓方能够缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的症状，改善其神经功能评分，促进受损后神经的再生与修复［9］。在此基础上，本实验通过体外培养原代星形胶质细胞，利用划痕法建立胶质瘢痕模型，观察补肾益髓方及其拆方补肾方和化痰活血方含药血清对机械损伤后星形胶质细胞活性及GFAP和CSPGs表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量180～220 g，以及新生24 h的SD乳鼠，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2016-0011。

1.2 试药与仪器 补肾益髓方由生地黄、熟地黄、制首乌、浙贝母、水蛭、全蝎，益母草等组成；补肾方组方药物主要有生地黄、熟地黄等；化痰活血方主要药物有浙贝母、水蛭、全蝎等，以上各药方由北京亚东生物制药有限公司制备成浸膏粉。DMEM-F12培养基（美国Hyclone公司）；青霉素及链霉素、胰蛋白酶及胎牛血清（美国Gibco公司）；多聚赖氨酸 （货号P1399，美国Sigma公司）。CCK-8试剂盒由日本株式会社同仁化学研究所提供；鸡抗GFAP多克隆抗体（货号ab4674）及Alexa Fluor647标记的山羊抗鸡IgY-H&L（货号ab150171）均由美国abcam公司提供；小鼠抗CSPGs单克隆抗体 （货号C8035）由美国Sigma公司提供；FITC488标记山羊抗小鼠IgG（货号ZF-0312）北京中杉金桥生物技术有限公司；DAPI（Southern Biotechg，货号0100-20）。CO2培养箱（美国Thermo公司）；酶标仪（美国Molecular Devices公司）；激光共聚焦显微镜（LEICA TCSSP5）；高内涵分析仪（Thermo 公司，型号ARRAY SCANxTI）

1.3 造模与分组 适应性喂养3 d后，将SD大鼠随机分为4组各10只，空白血清组（等量蒸馏水），补肾益髓方组（13.48 g生药/kg），补肾方组（6.36 g生药/kg），化痰活血方组（7.04 g生药/kg）。用蒸馏水将各组浸膏粉溶解，连续7 d灌胃，每日灌胃2次，间隔12 h。末次给药后2 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，4℃静置4 h，离心吸取血清并将同组血清混匀，用0.22 μm滤器过滤除菌，放置-20℃备用。

1.4 实验方法 1）原代星形胶质细胞的提取、纯化。取新生24 h内的SD乳鼠大脑皮层并剪碎成小块，用0.125%胰蛋白酶消化5 min，以40 μm筛过滤消化液，1000 r/min离心5 min，重悬细胞并将细胞种到经多聚赖氨酸包被过的T25 cm2细胞培养瓶中，置37℃，5%CO2孵箱中培养。待形成单层细胞层，置于恒温摇床180 r/min摇2 h后，调转速260 r/min震摇18 h，去除小胶质细胞及少突胶质细胞。换液后继续培养，待细胞长满80%左右，用0.125%胰酶消化传代，传代后星形胶质细胞经免疫荧光鉴定纯度达95%以上可用于实验。2）细胞分组及给药方法。细胞分为正常对照（NC）组，模型（MO）组，2.5%补肾益髓方组，5%补肾益髓方组，10%补肾益髓方组，每组各设3个平行孔，取传代后处于对数生长期的星形胶质细胞种于96孔板内，培养细胞贴壁后，用10 μL枪头呈“十”字划伤细胞层，尽量保持划痕大小和范围一致。NC组与MO组用空白血清处理，其余各组用不同浓度补肾益髓方含药血清处理，继续培养24 h测定星形胶质细胞的存活率。筛选出合适的补肾益髓方的浓度后，再将细胞分为NC组，MO组，5%补肾益髓方组，5%补肾方组，5%化痰活血方组，造模及用药方法同上，测定星形胶质细胞存活率及GFAP、CSPGs的表达。

1.5 标本采集与检测 1）细胞计数试剂法（CCK-8）测定细胞存活率。将星形胶质细胞以1×105/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，待细胞贴壁后，经划痕处理，对照组与用药组细胞均继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，混匀，培养箱中孵育1 h。酶标仪450 nm波长检测各孔的光密度值（OD值）。计算细胞存活率：（实验组OD值-空白组OD值）/（正常组OD值-空白组OD值）。2）高内涵法测定补肾益髓方及拆方含药血清对星形胶质细胞GFAP及CSPGs表达的影响。将细胞密度调整至8.5×105/mL，按100 μL/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后，划痕并给予含药血清处理24 h后，0.01 mol/L PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛室温固定30 min，冲洗。0.3%Triton X-100破膜处理5 min，冲洗。3%BSA/PBS封闭30 min后，加入GFAP（1∶1000）及 CSPGs（1∶200）抗体 4℃孵育 18 h，冲洗。加入Alexa Fluor标记山羊抗鸡IgY-H&L抗体（红色，1∶500）及FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体（绿色，1∶200）室温避光孵育 1 h，清洗。用 DAPI室温染核5 min，清洗。 最后以 100 μL/孔加入 0.01 mol/L PBS，应用Cellomics ArrayScan XTI高内涵筛选系统对GFAP及CSPGs蛋白进行测定和分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度补肾益髓含药血清对划伤后星形胶质细胞存活率的影响 见表1。模型（MO）组细胞存活率与正常对照（NC）组相比显著降低（P＜0.01），2.5%，5%，10%补肾益髓含药血清组细胞存活率与MO组相比均有不同程度升高 （P＜0.05或 P＜0.01），而5%、10%补肾益髓含药血清组优于2.5%补肾益髓组 （P＜0.05），5%补肾益髓方组细胞的存活率还高于10%补肾益髓方组，故选取5%补肾益髓方含药血清作为下一步实验用药浓度。

表1 不同浓度补肾益髓方含药血清对划伤后星形胶质细胞存活率的影响（%，±s）

表1 不同浓度补肾益髓方含药血清对划伤后星形胶质细胞存活率的影响（%，±s）

与 NC 组比较， **P＜0.01； 与 MO 组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与2.5%补肾益髓方组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 n NC组 3 MO组 3 2.5%补肾益髓方组 3细胞存活率100.00±7.49 60.77±4.22**69.19±3.37#5%补肾益髓方组 3 78.98±3.89##△10%补肾益髓方组 3 77.51±1.44##△

2.2 补肾益髓方及其拆方补肾方和化痰活血方含药血清对划伤后星形胶质细胞细胞存活率的影响 见表2。MO组细胞存活率较NC组显著降低（P＜0.01）。各治疗组即全方及拆方含药血清组细胞存活率与MO组相比，均有不同程度的上升（P＜0.01）。其中补肾益髓方组及补肾方组细胞存活率优于化痰活血方组 （P＜0.05或 P＜0.01）。

表2 补肾益髓方及拆方补肾方和化痰活血方含药血清对划伤后星形胶质细胞细胞存活率的影响（%，±s）

表2 补肾益髓方及拆方补肾方和化痰活血方含药血清对划伤后星形胶质细胞细胞存活率的影响（%，±s）

组 别 n NC组 3 MO组 3补肾益髓方组 3细胞存活率100.00±1.28 64.17±1.98**85.18±3.28##△△补肾方组 3 81.50±1.14##△化痰活血方组 3 74.89±4.55##

2.3 补肾益髓方及其拆方补肾方和化痰活血方含药血清对划伤后星形胶质细胞GFAP与CSPGs的影响见表3，图1。实验结果NC组免疫荧光染色显示，GFAP均匀地分布在星形胶质细胞细胞骨架。与NC组相比，MO组GFAP的平均光密度值较NC组显著性增高（P＜0.01），且划痕两侧GFAP荧光染色较非划痕区增强，可见反应性增生后聚集生长的星形胶质细胞，胞体增大，突起增粗、延长并向划痕中央区伸出。提示星形胶质细胞经划痕后活化明显。各用药组与MO组相比，GFAP的平均光密度值有所降低，但差异无统计学意义。NC组CSPGs的免疫荧光染色仅有少量表达，MO组CSPGs荧光染色表达增强呈强阳性，且主要集中在划痕两侧。MO组CSPGs的平均光密度值较NC组显著性地增高（P＜0.01），各用药组CSPGs的平均光密度值与MO组相比，均有所下调 （P＜0.05或P＜0.01），其中补肾益髓方组CSPGs的平均光密度值与化痰活血方组比较，下降较为显著（P＜0.05）。

表3 补肾益髓方及拆方补肾方和化痰活血方含药血清对划伤后星形胶质细胞GFAP及CSPGs表达的影响（±s）

表3 补肾益髓方及拆方补肾方和化痰活血方含药血清对划伤后星形胶质细胞GFAP及CSPGs表达的影响（±s）

组 别 n NC组 3 MO组 3补肾益髓方组 3补肾方组 3化痰活血方组 3 GFAP平均荧光密度值 CSPGs平均荧光密度值40.65±0.35 119.07±5.45 45.27±0.76** 154.68±4.48**44.30±0.59 134.52±6.03##44.68±0.10 142.68±2.76##44.89±0.92 143.31±2.95#△

图1 各组星形胶质细胞GFAP及CSPGs的表达变化（400倍）

3 讨 论

GFAP对于维持星形胶质细胞形态结构稳定及其功能发挥方面有着重要作用。CNS受损后，损伤区的星形胶质细胞反应性增生，GFAP表达量增多，不断堆积成为胶质瘢痕的主要组成部分［10-11］。相关研究表明，抑制GFAP的表达，减少星形胶质细胞的反应性增生能够减少胶质瘢痕的宽度和密度，拮抗其对轴突再生的阻碍作用［12］。划痕法为机械损伤属于离断模型的一种，能够模拟星形胶质细胞损伤后的机理反应，是常用的细胞损伤模型之一，用于模拟中枢神经受损后的研究［5］。此次实验中星形胶质细胞经划痕后形态改变，划痕两侧呈聚集生长，GFAP、CSPGs两种标志性蛋白均显著性地升高，表明胶质瘢痕模型制作成功。补肾益髓方及其拆方对划痕损伤后升高的GFAP的调控作用不明显，表明补肾益髓方对胶质瘢痕中星形胶质细胞损伤后活化及增生无明显作用。

无论在动物整体实验或体外实验中均表明CSPGs在受损区域积聚呈现高表达的状态，表现出了对轴突生长的抑制性［13-14］。CSPGs可与许多神经元表面受体结合，包括NgR1，NgR3，白细胞共同抗原相关蛋白（LAR），及其同系物 RPTP［15］，并通过激活 RhoA/ROCK信号通路，引起生长锥塌陷，抑制轴突的生长［16］。本团队此前实验研究表明，补肾益髓方及其拆方均能够不同程度地下调EAE小鼠脑及脊髓部位CSPGs的表达且能够减轻脑及脊髓部位轴突的损伤［9］。此次实验亦从体外方面证明了补肾益髓方及其拆方能够抑制CSPGs的表达，尤以补肾益髓方效果为佳，与前期整体研究结果一致。

樊永平教授认为中医药治疗多发性硬化有明显的优势，主要适用于缓解期，以促进髓鞘的修复为主。他认为多发性硬化主要病机为五脏失衡，肾虚髓空［17］。补肾益髓方重在补肾以扶正，佐以化痰活血袪邪。方中生地黄清热凉血养阴，熟地黄、何首乌填精益髓；浙贝母、天麻清热化痰熄风；益母草、水蛭、全蝎活血祛瘀通络，大黄、连翘清热解毒散结。此次研究中补肾益髓方及其拆方均能促进损伤后星形胶质细胞细胞活性，而补肾益髓方与补肾方优于化痰活血方，可能与补肾益髓方以补肾药物为主而补肾方药对神经细胞有显著地保护作用与修复作用有关［18］。补肾方与化痰活血方虽均可下调划痕后的CSPGs，而补肾益髓方全方干预抑制因子CSPGs表达的效果优于拆方补肾方与化痰活血方，说明通过补肾药物与化痰活血药物配伍协同发挥作用更有助于促进轴突的再生与修复。

［1］ Cheng Y，Sun L，Xie Z，et al.Diversity of immune cell types in multiple sclerosis and its animal model：Pathological and therapeutic implications［J］.J Neurosci Res，2017，95（10）：1973-1983.

［2］ Fang L，Zheng Q，Yang T，et al.Bushen Yisui Capsule ameliorates axonal injury in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Neural Regen Res，2013，8（35）：3306-3315.

［3］ Fujita Y，Yamashita T.Axon growth inhibition by RhoA/ROCK in the centralnervous system［J］.Front Neurosci，2014，8：338.

［4］ Baldwin KT，Giger RJ.Insights into the physiological role of CNS regeneration inhibitors［J］.Front Mol Neurosci，2015，8：23.

［5］ 汪今朝，范筱，张俐.活血通督汤对脊髓损伤后胶质瘢痕形成的影响［J］.中国中医骨伤科杂志，2017，25（8）：1-5.

［6］ 贾刘云，王森，王倩，等.中医药治疗多发性硬化的研究进展［J］.中医研究，2015，28（10）：75-78.

［7］ 周莉，樊永平.二黄方减少多发性硬化轴索损伤和复发的临床研究［J］.中国中医药信息杂志，2012，19（8）：14-15，30.

［8］ 房玲，樊永平，赵晖，等.补肾益髓方防治多发性硬化的研究进展［J］.中医药导报，2013，19（12）：108-110.

［9］ 安辰，王永强，师一民，等.补肾益髓方及其拆方对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经保护作用及NF200和CSPGs表达的影响［J］.中华中医药杂志，2016，31（4）：1215-1220.

［10］ Trapp BD，Ransohoff RM，Rudick R.Axonal pathology in multip lesclerosis： relationship to neurolog ic disability ［J］.Curr Op in Neurol，1999，12（3）：295-302.

［11］伍正彬，罗大林，蒋东坡.干扰表皮生长因子受体表达对脑出血后星形胶质细胞活化的影响及其机制［J］.实用临床医药杂志，2017，21（13）：12-16，21.

［12］陈安，廖君，熊艾君，等.补阳还五汤对脊髓损伤后胶质瘢痕及GFAP表达的影响［J］.世界中西医结合杂志，2007，2（10）：570-572.

［13］王莹，贾桦，李文媛，等.硫酸软骨素酶ABC在中枢神经系统中促进神经再生的作用［J］.解剖科学进展，2011，17（5）：484-486.

［14］谭斐，吴晓黎，景良，等.硫酸软骨素蛋白多糖抑制神经元轴突生长体外生物模型的建立［J］.中国医科大学学报，2011，40（1）：4-7，11.

［15］Huang JY，Wang YX，Gu WL，et al.Expression and function of myelin-associated proteins and their common receptor NgR on oligodendrocyte progenitor cells［J］.Brain Res，2012，1437：1-15.

［16］Muramatsu R，Yamashita T.Concept and molecular basis of axonal regeneration after central nervous system injury ［J］.Neurosci Res，2014，78：45-49.

［17］樊永平.多发性硬化中医病因病机和治疗［J］.环球中医药，2013，6（9）：668-670.

［18］刘蕾，郑琦，安辰，等.补肾配伍化痰活血药对低血清培养SH-SY5Y神经细胞轴突生长的影响［J］.中医药信息，2014，31（5）：5-9.