杨志鹏，王婷，袁峰，阮文婷，刘新利*

(1.齐鲁工业大学 生物工程学院，济南 250353；2.江苏神华药业有限公司，江苏 金湖 211600)

海棠果(CalophylluminophyllumL.)，即海棠树的果实，原产于我国，现主要分布在华北地区，其果皮色泽鲜红夺目，果肉黄白色，鲜食酸甜香脆[1]。海棠果中含有大量的营养物质，如糖类、多种维生素、有机酸等，能够补充人体所需的营养，增强对疾病的抵抗力，具有生津止渴、健脾开胃、涩肠止痢的功效。酵素是指以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品，其包含天然营养物质、酶、有益微生物及其活性代谢物。针对不同人群，酵素产品的原料配伍及工艺侧重点有所不同，酵素产品一是注重有针对性的营养补充，二是注重有针对性的营养均衡。酵素产品市场火热，也体现了大众认识到合理饮食对健康的重要性，防病于未然[2]。

海棠果酵素在国内外研究少见报道，该酵素以海棠果为主要原料，打浆机打浆后接入益生菌进行发酵，通过优化发酵条件，得到既富含多种营养成分，又包含活性益生菌及有益代谢产物的优质酵素产品。因此通过本项目开发海棠果酵素，并研究其活性物质、营养成分及功效评价，对于丰富酵素产品种类及其他酵素产品的开发具有指导意义。海棠果酵素采用鼠李糖乳杆菌进行发酵，待发酵完成后对海棠果酵素中的总糖、氨基酸、多酚、胆固醇去除率以及抗氧化性进行了研究，提供了较为详实的数据资料，开发的海棠果酵素对人体调节肠道平衡、清除胆固醇和延缓衰老具有重要作用。

1 材料与设备

1.1 菌株

发酵实验所用到的鼠李糖乳杆菌217-3为我实验室保藏菌株[3]。

1.2 设备

FE20型pH计、RS232-C型分光光度计、5417R型离心机、DJ1-0.12型打浆机、LDZX-50KB型灭菌锅、L-8900型氨基酸分析仪、SHP-150型恒温培养箱、UB-7型酸度计。

1.3 试剂和材料

1.3.1 乳酸菌培养基(MRS)

1 L配方为蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，柠檬酸三铵2 g，七水硫酸镁0.58 g，乙酸钠3.12 g，磷酸氢二钠1.63 g，乙酸钾2.25 g，吐温80 1 mL，四水硫酸锰0.25 g；胆固醇培养基；MRS-STC-CHOL培养基。

1.3.2 氯化钠溶液

0.85 g NaCl溶解于100 mL双蒸水中，灭菌后使用。

1.3.3 试剂

苯酚、浓硫酸、无水乙醇、葡萄糖、茚三酮、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、没食子酸、碳酸钠、福林酚试剂等：均为分析纯；DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)：Sigma 公司；乳清蛋白粉：蓝宇科贸有限公司。

2 试验方法

2.1 海棠果酵素的生产流程

选取新鲜海棠果→去核→打浆→果汁过滤→添加C，N源→调节pH值→灭菌→接入益生菌→发酵→检测pH值→后熟→成分检测→口感调节。

2.2 海棠果酵素发酵时间的测定

由于乳酸菌在MRS培养基中培养的时间为24 h左右，所以在海棠果酵素发酵24 h后，于超净工作台中每隔1 h取5 mL海棠果酵素用酸度计测其pH值。因为乳酸菌经过发酵后会产生乳酸，使得酵素pH下降，当海棠果酵素中的pH稳定后，海棠果酵素即发酵完成，随后逐渐进入后熟阶段。

2.3 海棠果酵素总糖含量的检测

采用苯酚-硫酸法测定酵素中总糖的含量[4]。

分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的标准葡萄糖工作液置于试管中，用蒸馏水补至1.0 mL。向试管中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，后快速加入5.0 mL硫酸，静置10 min。使用涡旋振荡器使反应液充分混合，后将试管放置于30 ℃水浴中反应20 min，490 nm处测吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线。随后取酵素样品，稀释至适宜浓度，用移液枪吸取适宜体积于试管中，重复上述操作，测定酵素稀释液的吸光度。

2.4 海棠果酵素氨基酸含量的检测

先采用茚三酮粗测氨基酸含量，然后使用氨基酸分析仪进样检测[5]。

准确吸取氨基酸标准溶液0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL，分别置于25 mL的容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0 mL，然后加入茚三酮溶液和磷酸盐缓冲溶液各1 mL，混合摇匀，于水浴上加热15 min，取出迅速冷却至室温，加水至标线(25 mL)，摇匀。静置15 min后，在570 nm波长下，以空白试剂为参比液测定其余各溶液的吸光度。以氨基酸的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。后吸取澄清的样品溶液1～4 mL，置于25 mL的容量瓶或比色管中，重复上述操作，测其吸光度。根据标准曲线和测出的样品吸光度，计算出氨基酸含量，稀释适宜倍数后用氨基酸分析仪进行检测。

2.5 海棠果酵素多酚含量的检测

用移液管分别移取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL的没食子酸标准储备液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度线，浓度分别为10,20,30,40,50 μg/mL。量取没食子酸工作液和蒸馏水各1 mL于试管内，再分别加入5.0 mL的10%福林酚试剂，摇匀，反应3～8 min内，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，摇匀，室温下放置60 min，用10 mm比色皿在765 nm波长下测吸光值[6]。以没食子酸的微克数为纵坐标，吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。量取1 mL待测液，重复上述操作，测其吸光度。

2.6 海棠果酵素胆固醇脱除能力的研究

血清中高胆固醇含量被认为是诱发高血压、冠心病等众多心血管疾病的重要因素。国内外大量临床实验证实，服用乳酸菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量、降低心血管疾病发病率的功效[7]。通过对实验室保藏的多种乳酸菌的胆固醇脱除率进行比较后，选择胆固醇脱除率最高的鼠李糖乳杆菌217-3为出发菌株，同时对开发的海棠果酵素的胆固醇脱除能力进行检测。

胆固醇标准曲线的绘制：将胆固醇工作液分别配制成不同浓度的胆固醇溶液(30,35,40,45,50,55 mg/L)，于550 nm下测定吸光值并绘制胆固醇标准曲线，并按照同样方法测定MRS-STC-CHOL培养基中的初始胆固醇含量。将富含活性鼠李糖乳杆菌的海棠果酵素以10%接种于MRS-STC-CHOL培养基中，37 ℃发酵24 h。测定培养上清液中胆固醇含量, 计算胆固醇去除率。胆固醇去除率按下式计算：

去除率=(初始胆固醇含量-上清液胆固醇含量)/初始胆固醇含量×100%。

2.7 海棠果酵素抗氧化性的研究

海棠果中富含多酚类物质和原花青素等黄酮类物质，是天然的抗氧化剂，对清除人体内自由基、抗衰老等方面具有极大的作用。加之采用乳酸菌进行发酵，提高了体内抗氧化物质活性，从而有效清除人体内的自由基。海棠果抗氧化性的研究采用DPPH抗氧化实验。二苯基苦基苯肼(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，DPPH·)是一种稳定的有机自由基，当样品中存在自由基清除物质时，会与自由基的单电子配对而使其吸收逐渐消褪，用分光光度法通过吸收值的变化可计算出样品清除自由基的活性，从而评价海棠果酵素的抗氧化活性[8]。

用100 μL一定浓度梯度的样品加入到试管中，然后向每管中加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，混匀避光37 ℃水浴1 h后在517 nm下测定吸光度值，以乙醇做空白对照，每个样品均平行测定3次，结果以SC50值表示。DPPH自由基清除率为50%时所需样品的浓度为SC50，DPPH自由基清除率按下式计算：

清除率(%)=[1-(As/Ac )]×100%。

式中: Ac为空白对照管的吸光度值；As为样品测定管的吸光度值。

3 结果与讨论

3.1 发酵菌种的选择

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)是一种常见的益生菌，在人体新陈代谢中起着关键作用。该菌属于乳杆菌(Lactobacillus)属、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)种，革兰氏阳性菌，无质粒，由于其糖代谢时可代谢单糖而不可代谢乳糖而得名。鼠李糖乳杆菌肠道黏着率高，定植能力强，并具有高效降胆固醇、促进细胞分裂的能力，可起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿、提高机体免疫力及抗癌等重要生理保健功能，可广泛应用于青贮饲料、功能食品和医疗保健等领域[9]。

3.2 海棠果酵素发酵时间的确定

自接入益生菌菌株后，每隔4 h对海棠果酵素的pH值和活菌数进行检测，在56 h内海棠果酵素的pH值和活菌数变化曲线见图1。

图1 56 h内海棠果酵素pH值和活菌数变化曲线

由图1可知，海棠果酵素在前4 h内，pH值只是略微下降，这是由于接入的益生菌仍处于延滞期，生长缓慢。进入对数期后，pH值呈快速下降的趋势，4～24 h，pH值从6.32迅速下降至3.43。这阶段pH值的快速下降主要归结于鼠李糖乳杆菌的快速增殖需要消耗糖代谢提供的能量，由此生成乳酸速度加快。随着乳酸的不断生成，海棠果果汁的缓冲能力不断增强以及鼠李糖乳杆菌的生长代谢受到抑制，进入稳定期后pH的变化不再明显，直至48 h左右，pH值基本不再发生变化，稳定在3.02左右。由活菌数曲线可以看出，开始发酵的4 h内，酵素中的活菌数并无明显变化。4 h之后，鼠李糖乳杆菌进入指数期，活菌数迅速升高，并于24 h左右趋于稳定，进入稳定期，基本符合其pH值的变化。由此判定该海棠果酵素的发酵时间为48 h。

3.3 海棠果酵素总糖含量的检测结果

葡萄糖溶液的标准曲线见图2。

图2 葡萄糖溶液标准曲线

海棠果酵素的10倍稀释样品在490 nm处的吸光度为0.217，由图2标准曲线可知，海棠果酵素的总糖含量为175 mg/L。

3.4 海棠果酵素氨基酸含量的检测结果

氨基酸溶液的标准曲线见图3。

图3 氨基酸溶液标准曲线

海棠果酵素的100倍稀释样品在570 nm处的吸光值为0.163，由图3标准曲线可知，海棠果酵素的氨基酸含量大致为1.422×103mg/L。在使用氨基酸分析仪检测后，经数据分析得出海棠果酵素中的氨基酸总量为1.83×103mg/L，可以检测到16种氨基酸，含量最高的为脯氨酸，为0.52×103mg/L，排在前4位的氨基酸分别为脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和缬氨酸，酵素中必需氨基酸的含量/氨基酸总含量为0.409，达到了联合国粮食与农业组织(Food and Agriculture Organization，FAO)/世界卫生组织(World Health Organization，WHO)提出的蛋白质中必需氨基酸与总氨基酸的比值应在0.40以上的参考蛋白模式[10]。

3.5 海棠果酵素多酚含量的检测结果

多酚的标准曲线见图4。

图4 没食子酸标准曲线

海棠果酵素的20倍稀释样品液在765 nm处的吸光度为0.3452，由标准曲线可知，该海棠果酵素的多酚含量为5.73×102mg/L。

3.6 海棠果酵素去除胆固醇能力的检测结果

胆固醇标准曲线见图5。

图5 胆固醇标准曲线

海棠果酵素胆固醇去除率见表1。

表1 海棠果酵素胆固酵去除率

通过结果分析得出MRS-STC-CHOL培养基中初始胆固醇含量为200 mg/L，上清液的胆固醇含量的53.3 mg/L，因此海棠果酵素的胆固醇降解率为73.4%。对清除人体内胆固醇具有显著效果。

3.7 海棠果酵素清除自由基能力的检测结果

采用DPPH抗氧化实验计算出海棠果酵素的自由基清除能力，清除率曲线见图6。

图6 海棠果酵素清除率曲线

根据曲线可以得出海棠果酵素的自由基清除率较高，具有较高的抗氧化活性，其SC50值为0.0715。

4 总结

本文以开发具有高生物活性的海棠果酵素产品为研究目的，通过优选活性益生菌菌株，跟踪检测发酵过程pH值、活菌数、总糖、氨基酸和多酚含量，确定了海棠果酵素的发酵时间，并通过海棠果酵素的胆固醇脱除能力，对海棠果酵素的体外益生功能做了评价。该产品具有潜在的调节人体内肠道平衡，提高机体抗氧化能力和免疫水平，帮助营养物质的消化和吸收，延缓衰老，促进身心健康的功效，酸甜可口，适于多种人群的合理膳食。

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[8]陈芳甜.观赏海棠果抗氧化活性的研究[D].泰安：山东农业大学,2012.

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