于鑫，吕嘉枥，余芳

(陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

近年来，益生菌的研究在全球范围内已经形成热潮，益生作用已经被国际公认并不断发现新的功能。国内外研究表明：某些益生菌菌体及其代谢产物具有抗氧化活性[1]，主要表现在产生的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等一些抗氧化酶。超氧化物歧化酶(SOD)是一种以超氧阴离子为底物的金属酶，能催化超氧自由基发生歧化反应，在抗衰老[2]方面起着重要的作用。过氧化氢酶(CAT)是广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，其功能是催化细胞内过氧化氢分解，防止氧化[3]。

国内在乳酸菌产SOD酶和CAT酶方面的研究有报道，其中邢德明等[4-7]研究表明嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等乳酸菌在MRS肉汤培养基中均可以产生SOD酶和CAT酶；沈明华等[8-10]研究了乳酸菌发酵鲜牛乳产SOD酶活性的变化，其中有的发酵后SOD酶活性提高，有的变化不大。目前对于发酵鲜乳产CAT酶活性的研究相对较少，马森等研究结果表明发酵乳中CAT酶活性比鲜乳的低；杨小幸等[11，12]研究了益生菌发酵果蔬过程中能产生SOD酶。

本实验选用10株益生菌分别在MRS肉汤培养基、鲜牛乳培养基和蔬菜汁培养基中培养，研究它们在发酵过程中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，为抗氧化功能性食品的研究提供了依据。

1 材料与方法

1.1 原材料与试剂

1.1.1 原材料

荸荠、菊芋、油麦菜、芹菜、莴笋、鲜牛乳：西安华润万家超市提供。

1.1.2 菌种

保加利亚乳杆(Lactobacillusbulgaricus, LB)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus, LA)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum, LP)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalisubsp., Bb)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus, LGG)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei, LCP)、粪链球菌(Enterococcusfaecalis, EF)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophiles, ST)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei, LC)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri, LR)：由陕西科技大学食品与生物工程学院微生物研究室提供。

1.1.3 试剂

葡萄糖(生化试剂)、七水硫酸镁(分析纯) 西安化学试剂厂；酵母浸粉(生化试剂)、牛肉膏(生化试剂)、蛋白胨(生化试剂) 北京奥博星生物技术有限公司；硫酸锰(分析纯) 西安东升化工有限公司；吐温-80(分析纯) 天津恒昊公司化学试剂厂；磷酸氢二钾(分析纯)、乙酸钠(分析纯) 天津市化学试剂厂；柠檬酸氢二铵(分析纯) 天富精细化工有限公司；超氧化物歧化酶(SOD酶)试剂盒、过氧化氢酶(CAT酶)试剂盒 南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

QSX-280B手提式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；JY-502电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；YC-26L医用冷藏冰箱 中科美菱低温科技有限公司；DH-360电热恒温培养箱 北京科伟永兴仪器有限公司；GNP-9160隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；UV-2600紫外分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司。

1.3 培养基

1.3.1 MRS肉汤培养基

牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉5 g，硫酸锰0.25 g，吐温-80 1 mL，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2 g，七水硫酸镁0.58 g，蒸馏水1000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

1.3.2 鲜牛乳培养基

鲜牛乳于115 ℃高压蒸汽灭菌15 min，备用。

1.3.3 蔬菜汁培养基

将荸荠、菊芋、油麦菜、芹菜和莴笋除去杂物，彻底清洗干净，采用打浆机榨汁，过100目筛，备用。

1.4 实验方法

1.4.1 10株乳酸菌产超氧化物歧化酶(SOD)活性的研究

将已活化好的10株乳酸菌按1%比例接种到MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养箱中静置培养48 h，发酵液离心后，取上清液测SOD酶的活性。

1.4.2 10株乳酸菌产过氧化氢酶(CAT)活性的研究

将10株乳酸菌菌种按1%比例接种到MRS液体培养基中，在37 ℃条件下静置培养48 h，取离心后的上清液测定CAT酶的活性。

1.4.3 10株乳酸菌发酵乳产SOD酶活性的研究

将已活化好的10株乳酸菌接种到灭完菌的鲜牛乳中，37 ℃恒温培养箱中静置培养至凝乳，发酵乳离心后取上清液测定SOD酶活力。

1.4.4 10株乳酸菌发酵乳产CAT酶活性的研究

将10株乳酸菌接种到灭完菌的鲜牛乳中，在37 ℃下静置培养至凝乳，发酵乳离心后取上清液测定CAT酶活力。

1.4.5 10株乳酸菌发酵蔬菜产SOD酶活性的研究

将已活化好的10株乳酸菌按1%的接种量接种到复合蔬菜汁培养基中，以不接菌种的蔬菜汁培养基为空白对照，在37 ℃恒温培养箱中静置培养48 h，发酵液离心后取上清液测定SOD酶的活力。

1.4.6 10株乳酸菌发酵蔬菜产CAT酶活性的研究

将已活化好的10株乳酸菌按1%的接种量接种到蔬菜汁培养基中，以不接菌种的复合蔬菜汁培养基为空白对照，在37 ℃恒温培养箱中静置培养48 h，发酵液离心后取上清液测定CAT酶的活力。

1.5 测定方法

1.5.1 SOD酶测定方法[13]

采用羟胺法。

1.5.2 CAT酶测定方法[14，15]

采用可见光法。

2 结果与分析

2.1 10株乳酸菌产SOD酶能力

以10株乳酸菌为菌种，接种到MRS肉汤培养基中，以不接菌的培养基为空白，取发酵48 h的发酵液测定SOD酶活力，结果见图1。

图1 乳酸菌发酵48 h时SOD酶活力变化

由图1可知，10株乳酸菌在MRS肉汤培养基中均可以产生SOD酶。与空白组相比发现，LA产生的SOD酶最多，活力可达到38.45 U/mL，其次是LCP，LC，BL，活力依次为36.24，28.43，26.21 U/mL。

2.2 10株乳酸菌产CAT酶能力

以10株乳酸菌为菌种，接种到MRS肉汤培养基中，以不接菌的培养基为空白，取发酵48 h的发酵液测定CAT酶活力，结果见图2。

图2 乳酸菌发酵48 h时CAT酶活力变化

由图2可知，与空白组相比10株乳酸菌均产生CAT酶，其中LA产CAT酶活力最多，活力达到8.56 U/mL，其次是LCP和BL，活力依次是7.23，5.36 U/mL，其他几株乳酸菌的CAT酶活力差别不明显。

2.3 10株乳酸菌发酵乳产SOD酶能力

以10株乳酸菌为菌种，接种到鲜牛乳培养基中，以不接菌的培养基为空白，取发酵至凝乳的发酵乳离心，取上清液测定SOD酶活力，以菌株为横坐标，SOD酶活力为纵坐标，绘制柱形图，结果见图3。

图3 乳酸菌发酵乳48 h时SOD酶活力变化

由图3可知，10株乳酸菌在鲜牛乳培养基中发酵48 h均产生SOD酶，其中， LA产SOD酶量最多，活力可达到50.34 U/mL，与在MRS肉汤培养基中相比SOD酶的活力提高了30%，其次是LCP，BL和LC，活力在47.51～39.45 U/mL之间，其他几株菌产生的SOD酶相对较少。

2.4 10株乳酸菌发酵乳产CAT酶能力

以10株乳酸菌为菌种，接种到鲜牛乳培养基中，以不接菌的培养基为空白，取发酵至凝乳的发酵乳离心，取上清液测定CAT酶活力，以菌株为横坐标，CAT酶活力为纵坐标，绘制柱形图，结果见图4。

图4 乳酸菌发酵乳48 h时CAT酶活力变化

由图4可知，以不接菌种的培养基为空白组，10株乳酸菌发酵鲜牛乳时均产生CAT酶，其中LA产CAT酶最多，活力达到9.89 U/mL，这与在MRS肉汤培养基中相比酶活力提高幅度较小，其次是LCP，BL，活力依次是8.56，6.57 U/mL，其他几株乳酸菌的CAT酶活力差异不明显。

2.5 10株乳酸菌发酵蔬菜产SOD酶的能力

以10株乳酸菌为菌种，接种到蔬菜汁培养基中，以不接菌的培养基为空白，取发酵48 h的发酵液离心，取上清液测定SOD酶活力，以菌株为横坐标，SOD酶活力为纵坐标，绘制柱形图，结果见图5。

图5 乳酸菌发酵蔬菜48 h时SOD酶变化

由图5可知，以不接菌种的复合蔬菜培养基为空白组，10株乳酸菌均产生SOD酶，其中LA产SOD酶量最多，活力可达到118.56 U/mL，这与在MRS肉汤培养基中相比酶的活力提高了2倍，其次是LCP，BL和LC，活力在115.42～99.58 U/mL之间，其次是LP，LCP，ST，LR，SF和LB，产生的SOD酶相对较少。

2.6 10株乳酸菌发酵蔬菜产CAT酶的能力

以10株乳酸菌为菌种，接种到复合蔬菜汁培养基中，以不接菌的培养基为空白，取发酵48 h的发酵液离心，取上清液测定CAT酶活力，以菌株为横坐标，CAT酶活力为纵坐标，绘制柱形图，结果见图6。

图6 乳酸菌发酵蔬菜48 h时CAT酶变化

由图6可知，10株乳酸菌发酵复合蔬菜培养基时均产生CAT酶，其中LCP产CAT酶最多，活力达到41.06 U/mL，这与MRS肉汤培养基相比酶活提高了5倍左右，其次是LA，活力是38.84 U/mL，其次是LC，BL，活力依次是31.27，28.53 U/mL，其他几株乳酸菌的CAT酶活力与空白组相比差别不大。

3 结论

10株乳酸菌在MRS肉汤培养基、鲜牛乳培养基和复合蔬菜汁培养基中都可以产生SOD酶和CAT酶，在MRS肉汤培养基中SOD酶活力在9.82～38.45 U/mL之间，CAT酶活力在1.25～8.56 U/mL之间；在鲜牛乳培养基中SOD酶活力在14.92～50.34 U/mL之间，CAT酶活力在2.25～9.89 U/mL之间；在蔬菜汁培养基中SOD酶活力在76.20～118.56 U/mL之间，CAT酶活力在11.12～41.06 U/mL之间。其中益生菌在蔬菜汁培养基发酵过程中产SOD酶和CAT酶的活力相对较高。

[1]张江巍,曹郁生.乳酸菌抗氧化活性的研究进展[J].中国乳品工业,2005,33(1):34-37.

[2]Huang J Z,Lemire B D.Mutations in the Cl elegans succinate dehydrogenase ironsulfur subunit promote superoxide generation and prematuteaging[J].Mol Biol,2009,387:559-569.

[3]张坤生,田荟琳.过氧化氢酶的功能及研究[J].食品科技,2007,32(1):8-11.

[4]邢德明,李新华,袁慎亮,等.SOD乳酸菌高产菌株筛选鉴定及SOD分离纯化[J].食品与生物技术学报,2016,35(2):156-161.

[5]高大威,朱光华,王立欣,等.三种食物中乳酸菌的亲缘关系及抗氧化活性研究[J].燕山大学学报,2012,36(1):84-88.

[6]张凤敏.抗氧化益生乳酸菌的筛选[D].无锡：江南大学,2007.

[7]高晶.鼠李糖乳杆菌抗氧化活性的研究[D].长春：吉林农业大学,2011.

[8]沈明华.鲜乳及发酵乳中SOD和T-AOC的活性变化[J].中国奶牛,2008(2):45-47.

[9]马森.发酵乳中SOD、CAT、GSH-Px、GST活性的变化[J].乳业科学与技术,2007,30(2):67-68.

[10]曾宪碧,刘清敏.双歧多益生菌多功能酸奶[P].中国专利：CN101611738A，2009-12-30.

[11]杨小幸.果蔬酵素饮料制备及其抗氧化性能[A].中国食品科学技术学会第十三届年会论文摘要集[C].中国食品科学技术学会,2016.

[12]李雪,和兴萍,陈丹,等.乳酸菌发酵混合蔬菜的初步研究[J].中国酿造,2016,35(9):176-179.

[13]徐东,赵建,黄汉昌,等.改良的黄嘌呤氧化酶法测定动植物组织中SOD比活力[J].食品科学,2011,32(6):237-241.

[14]刘砚韬,王振伟,张伶俐.过氧化氢酶活性测定的新方法[J].华西药学杂志,2013,28(4):403-405.

[15]王华芳,展海军.过氧化氢酶活性测定方法的研究进展[J].科技创新导报,2009(19):7-8.