赵晶晶 汪琪璇 蔺欣 李根 宋雷 吴皓

上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科(上海200011)上海交通大学医学院耳科学研究所(上海200092)上海耳鼻疾病转化医学重点实验室(上海200092)

1 线粒体及其DNA的结构和功能

线粒体（mitochondrial）是真核细胞中的一种多功能细胞器，大小为0.5-1μm，位于细胞质内。每个细胞含有数百个线粒体，他们是细胞的“动力工厂”，为细胞提供能量，同时也参与细胞的氧化代谢、离子稳态、信号转导、细胞分化和细胞凋亡等过程，发挥多种作用[1]。线粒体拥有独立于细胞核染色体基因组外的DNA，称为线粒体DNA（mitochondrial DNA，mt DNA），占有核细胞总DNA的0.5%，具有自我复制、转录和编码的功能。每个线粒体含有2-10个mtDNA，其分子量约16,568个碱基对，形成环状裸露的双链DNA结构。mtDNA中没有内含子，含有37个连续编码的基因，可编码2种核糖体RNA（12Sr RNA 和 16S r RNA）、22种转运 RNA（t RNA）及13种信使 RNA(m RNA)[2]。其中13种线粒体编码蛋白与60多种核编码蛋白共同构成氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)所需的呼吸链，以复合体的形式分布在线粒体的内膜上，其功能是进行电子传递、氢传递及氧的利用，驱动ATP合成，同时释放氧活性产物（reactive oxygen species，ROS）[1]。

2 线粒体功能障碍及其DNA突变

自从Luft等人[3]在1962年发现世界上首例线粒体疾病患者以来，人们已经发现了许多线粒体功能障碍导致的疾病，如Alzheimer’s病,Huntington’s病,肌萎缩性脊髓侧索硬化症，以及感音神经性听力损失等[4]。引起线粒体功能障碍的因素有多种，其中最主要来源就是mtDNA突变，包括mtDNA基因组遗传序列的改变(如缺失、重组、点突变)，核基因突变继发的mtDNA多重缺失或减少,以及自体突变（如自由基介导的mtDNA损伤或错误修复）等[4]。

mtDNA突变致病存在阈值效应[5]，即只有在突变的mtDNA累积达到一定阈值，正常的mtDNA不足以使线粒体维持正常氧化还原功能时，才会表现出疾病症状。然而，由于线粒体是细胞进行氧化磷酸化的场所，mtDNA紧邻呼吸链，长期暴露于高水平ROS的环境中，作为缺乏组蛋白保护的裸露双链DNA，极易受到氧化损害；而mtDNA受损后的自身修复能力低下，因此其在自然界中突变率相当高。此外，mtDNA中没有内含子，突变常常位于重要基因的编码区，损害相关蛋白质（如氧化磷酸化酶等）的功能，导致线粒体功能障碍，氧化磷酸化过程异常，细胞能量（ATP）供应不足，自由基产物（如ROS）堆积，甚至细胞凋亡[6]。

3 线粒体功能障碍与遗传性非综合征型听力损失

遗传性听力损失是人类最常见的先天性疾病之一，占先天性听力损失的50%以上，其中约70%是非综合征性听力损失（non-syndromic hearing loss，NSHL）[7]。其特征是不伴有其他症状的感音神经性听力损失。mtDNA突变是导致遗传性非综合征性听力损失发病的重要原因之一，还和药物性听力损失、年龄相关性听力损失、迟发性听力损失等后天性听力损失有密切的联系[8]。

3.1 线粒体功能障碍导致听力损失可能的机制

所有的有核细胞中均含有线粒体，但不同器官组织细胞中线粒体的含量可以存在很大差异。能量需求大，对氧化磷酸化依赖程度高的细胞中，mtDNA相对更容易发生突变，根据阈值效应[5]，也更容易导致线粒体疾病。

许多研究表明，在耳蜗的外毛细胞、支持细胞和血管纹中均含有丰富的线粒体，尤其是在高频听力中起重要作用的耳蜗底圈外毛细胞中，线粒体的数量更多[9]。这些线粒体氧化磷酸化产生的ATP为耳蜗在声音传递生理过程中的活动提供大量的能量，但与此同时也产生大量的自由基产物，如ROS。正常生理情况下，耳蜗组织细胞自身的氧自由基清除系统能够清除多余的ROS，但当mtDNA突变导致线粒体功能受损时，耳蜗中过量的ROS堆积，加重线粒体的损伤，对细胞产生兴奋性毒性作用，并诱发凋亡信号通路的激活，最终可导致内耳细胞死亡，造成听力损失[4]。

3.2 线粒体功能障碍与人类非综合征型听力损失

线粒体功能障碍主要由mtDNA突变引起，其相关听力损失具有母系遗传、多因素复杂疾病的特点，其最常见形式是年龄相关性听力损失，受到环境因素（如耳毒性药物）的作用，同时也可能受核基因的调控。目前已知的人类听力损失相关mtDNA突变位点主要位于12S rRNA和tRNA基因上，其中12S rRNA基因突变多与NSHL有关，而tRNA基因突变多与综合征型听力损失（syndromic hearing loss，SHL）有关。目前关于16S rRNA基因突变与听力损失相关的报道不多且机制不明。近年来的动物实验研究也发现了许多核基因调控线粒体功能障碍相关的听力损失。下面仅主要介绍几种人类NSHL相关的mtDNA突变及相关调控的核基因。

3.2.1 mtDNA12S rRNA突变致线粒体功能障碍与NSHL

相关分子流行病学调查显示[7]，线粒体12S rRNA基因突变约占NSHL病因的3%，也是中国人群NSHL三大最常见的致病基因之一，目前研究较多的包括A1555G、C1494T、A827G、961、T1095C等多个突变位点。

mtDNA 12SrRNA A1555G突变是首个被确定与NSHL相关的线粒体突变类型[10]，以管敏鑫等为代表的研究者曾对一个携带mtDNA 12SrRNA A1555G突变的阿拉伯-以色列耳聋家系患者进行了深入的研究，发现该突变是耳聋发病的重要原因。研究表明A1555G突变发生在mtDNA 12SrRNA与氨酰tRNA结合的高度保守编码区域，该突变使得12SrRNA上第1494个位点和第1555个位点形成新的碱基对（C1494-1555G）[11]。

mtDNA 12SrRNA C1494T突变于2004年首次在中国家系中被发现[12]，其突变位点同样在12S rRNA的高度保守区域形成新的碱基对（U1494-1555A），结构与A1555G突变相似。

携带这些突变的12SrRNA二级结构改变，其空间结构更像细菌的核糖体基因，形成与氨基糖苷类药物作用的靶点非常相似的结合位点，一旦接触氨基糖苷类抗生素并与之紧密结合，就会影响细胞线粒体蛋白质的合成，可能造成包括毛细胞在内的相关细胞功能的损伤。

此外，最新的动物研究进一步阐述了引起母系遗传性耳聋的A1555G mtDNA突变致听力损失的机制，其部分通过甲基转移酶mtTFB1增加线粒体12S rRNA的甲基化来破坏线粒体核糖体功能。Raimundo[13]等人构建了过度表达线粒体12S rRNA甲基转移酶的转基因小鼠(Tg-mtTFB1 M），发现其存在迟发性渐进性听力损失的表现，模拟了人类中A1555G突变的病理过程。研究发现Tg-mtTFB1小鼠在耳蜗组织中产生过量的ROS，激活ROS-AMPK-E2F1通路导致细胞凋亡[13]。血管纹和螺旋神经节的功能受到影响，从而出现渐进性听力损失，类似于人类A1555G mtDNA突变患者中观察到的渐进性听力损失。Tg-mtTFB1小鼠血管纹功能障碍表现在耳蜗内淋巴电位（Endocochlear Potential，EP）降低，但并没有明显的血管纹萎缩迹象[14]。这与通过线粒体应激途径激活E2F1仅发生在内耳某些关键细胞（如血管纹和螺旋神经节细胞）中具有一致性[13]。

同时发现，线粒体ROS-AMPK-E2F1致病信号传导途径在体内通过遗传地减少腺嘌呤核苷酸激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)或转录因子E2F1信号传导挽救Tg-mtTFB1的听力损失[13-14]。因此，可通过抑制AMPK活性来抑制ROS-AMPK-E2F1通路，从而减少细胞凋亡，缓解听力损失，提示通过降低AMPK的活性具有潜在的治疗价值[14]。

临床上mtDNA 12S rRNA突变导致的听力损失通常与使用氨基糖苷类抗生素相关，一般发生在用药后数天至数月，主要表现通常为双侧严重的高频听力损失[15]。但其听力损失严重程度不等，也存在不完全外显的表现，最近有研究提出，mtDNA 12S rRNA突变的致病作用可能也受到核基因的调控，迄今为止仍是研究的热点[16]。

3.2.2 mtDNA tRNA突变致线粒体功能障碍与NSHL

mtDNA的重链和轻链共可编码22种tRNA，其作用主要是携带氨基酸，指导蛋白质的合成。tRNA具有高度保守性，其突变分为原发突变和继发突变，分别可以直接或间接协同导致听力损失[17]。

目前对NSHL相关研究较多的是位于mtDNA轻链编码tRNA（Ser）（编码为 UCN）的基因突变，其多为原发性突变[18]，可能通过影响tRNA前体的加工使线粒体功能受损，也可能与核酸修饰及氨酰化相关，最终导致听力损失。目前研究发现与 NSHL 相关的 tRNA（Ser）（UCN）突变包 括A7445G，7472insC，T7505C，T7510C，T7511C，以及G7444A等[19]。

此外，也有许多研究分别报道了tRNALeu（UUR）、tRNAThr、tRNAPhe[20]、tRNAHis等基因突变与NSHL相关[21]。

3.2.3 核基因调控的线粒体功能障碍与NSHL

调控线粒体功能的核基因也是近年来线粒体功能障碍相关NSHL的研究热点，研究主要集中在通过相关动物模型探索其致病机制和通路上。

线粒体保护蛋白Fus1具有调节线粒体Ca2+稳态，从而调节细胞内Ca2+偶联过程的功能[22]。Fus1的缺失导致线粒体中Ca2+积聚效率低下，极大程度地改变ROS产生，钙摄取，线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），呼吸储备能力和线粒体动力学等[22]。Fus1 KO小鼠模型首先由Ivanova AV.建立，Winston J.T.Tan等人利用该模型发现了线粒体蛋白Fus1在保护年龄相关性听力损失的新作用[23]。线粒体功能障碍和氧化应激是Fus1缺陷小鼠的主要致病机制。Tan等人对Fus1 KO小鼠进行ABR测量，结果显示从4至5个月大开始，Fus1 KO小鼠的全频听力呈进行性显著下降，且听力表型与年龄相关性听力损失（Age-related Hearing loss，ARHL）小鼠相一致[23]，因此可通过研究Fus1 KO小鼠听力损失的分子机制来探索出适用于预防人类年龄相关性听力损失的方法。Fus1 KO小鼠具有组织特异性的高水平ROS和抗氧化不足的特征，血管纹和螺旋韧带是受损的主要靶组织，导致迟发性渐进性听力损失。短期使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）可以防止Fus1 KO小鼠血管纹和螺旋神经节功能退化，并防止ABR阈值上升、波幅下降和潜伏期延长，维持正常EP水平及线粒体形态[23]。

核编码的线粒体聚合酶(mitochondrial DNA polymerase gamma，Polgγ)是动物细胞线粒体中唯一已知的具有保守的聚合酶和核酸外切酶结构域的DNA聚合酶，可修复mtDNA突变[24]。POLG突变小鼠缺乏修复mtDNA突变的能力，mtDNA突变的年龄相关性积累可能导致ROS产生增加，进而导致进一步的ARHL.POLG突变的小鼠在9-10个月龄时，中低频率ABR阈值明显提高，说明mtDNA的突变在ARHL的发生中起到因果作用[25]。这些结果与人类中的由于POLG突变而导致的Alpers综合征的表现一致，均与线粒体功能障碍引起的听力损失相关[26]。

线粒体过氧化氢酶（mitochondrial catalase,MCAT）是一种可去除存在于线粒体中的过氧化氢的抗氧化酶，Schriner等人首次建立了过度表达MCAT的小鼠模型[27]。此后Someya等人发现MCAT小鼠在13个月龄时的平均ABR阈值显著低于同龄WT小鼠，这表明MCAT过表达可减缓ARHL的发展[28]。此外，缺乏超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1,Sod1)的小鼠表现出年龄相关的耳蜗毛细胞损失明显增加[29]；缺乏谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione peroxidase,Gpx1）或Sod1的小鼠也表现出对噪声性听力损失更加易感[30]。

4 总结与展望

线粒体功能障碍相关的听力损失的发病率占所有遗传性NSHL的约3%，而遗传性NSHL中线粒体遗传大约为1%[31]，具有母系遗传的特性，与药物性听力损失、迟发性年龄相关听力损失等密切相关。其中迟发性听力损失的主要致病机制涉及氧化磷酸化过程异常、细胞内ROS增加、ROS-AMPK-E2F1通路激活诱发的细胞损伤和凋亡等，在临床尚无有效的预防及治疗手段。根据这一机制研究预防和治疗策略可能是降低线粒体相关迟发性听力损失发病率的有效措施。目前，通过干预线粒体ROS-AMPK-E2F1通路预防相关听力损失已在动物模型中应用并取得了成功，这对认识线粒体功能障碍致听力损失的机制，以及针对相关通路开展靶向治疗具有重要意义。

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