王安远+丁健+李志杰+吴利敏

[摘要] 目的 探讨Cyr61在增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中表达差异及其意义。方法 取自愿捐献的增生性瘢痕及正常皮肤标本，采用组织块法进行原代成纤维细胞培养。采用实时定量PCR法及细胞免疫荧光法检测Cyr61在两种细胞中的表达。结果 在mRNA水平及蛋白水平上，Cyr61在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达均高于正常皮肤成纤维细胞。结论 Cyr61在增生性瘢痕形成过程中可能存在一定的作用，可能通过调节胶原代谢以及调节成纤维细胞增殖影响增生性瘢痕的形成。

[关键词] Cyr61；增生性瘢痕；成纤维细胞；创面愈合

[中图分类号] R622 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）30-0037-04

[Abstract] Objective To observe the differential expression and significance of Cyr61 in hypertrophic scar and normal skin fibroblasts， and to explore its significance. Methods The hypertrophic scar and normal skin specimens voluntarily donated were taken. Primary fibroblasts were cultured using tissue block method. The expression of Cyr61 in two kinds of cells was detected by real-time quantitative PCR and immunofluorescence. Results The expression of Cyr61 in hypertrophic scar fibroblasts was higher than that in normal skin fibroblasts at mRNA level and protein level. Conclusion Cyr61 may have a role in the formation of hypertrophic scars， which may affect the formation of hypertrophic scars by regulating collagen metabolism and regulating fibroblast proliferation.

[Key words] Cyr61； Hypertrophic scar； Fibroblasts； Wound healing

增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖分化以及细胞外基质（extracellular matrix， ECM）过度沉积为特征的皮肤纤维化疾病，探索皮肤过度纤维化的机制以及控制纤维化进程成为防治增生性瘢痕的焦点。Cyr61属于CNN家族的一员，是一种分泌性的基质细胞蛋白。目前多数研究认为Cyr61在内皮细胞及皮肤成纤维细胞中参与细胞的粘附、迁移以及细胞外基质的合成[1-3]。在创面的愈合过程中，Cyr61在成纤维细胞中呈现动态的表达，并可通过诱导成纤维细胞衰老产生抗纤维化作用[4]。本研究采用realtime-PCR、细胞免疫荧光以及WesternBlot技术，检测Cyr61在增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞中mRNA及蛋白表达情况，以探讨其与增生性瘢痕发生的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），Dispase（日本Sanko公司），兔抗人CYR61多克隆抗体（美国Abcam公司），Trizol（美国Invitrogen公司），SYBR Green PCR试剂盒（上海达为科生物科技公司），Real-timePCR检测仪（美国ABI公司），低温冷冻离心机（美国Sigma公司），激光共聚焦显微镜（日本OLMPUS公司）。

1.2 标本来源

增生性瘢痕组织分别来自我院3例临床瘢痕增生患者，其中男2例，女1例，年龄15、16、20岁，标本分别取自于大腿外侧2例及前臂1例，瘢痕生长时间不超过1年。正常皮肤组织分别取自正常人群大腿2例和上臂1例，年龄16、18、21岁，男2例，女1例。

1.3 细胞培养

无菌条件下，用PBS液冲洗组织块3遍，剪弃脂肪和结缔组织。用刀片割成1～2 mm宽的小皮条，置于培养皿中，加入2.0 U/mL的DispaseⅡ，4℃中冷消化，16～18 h后分离表皮真皮，将表皮剪成1～2 mm3的小组织，放入培养瓶中，加入3～5 mL含20%胎牛血清的DMEM培养液，在环境设为37℃、含5 %CO2的培养箱中培养，3 d换次培养液。培养5～7 d可见成纤维细胞，爬满瓶底后用 0.25%胰蛋白酶消化传代。本实验取第3～5代的成纤维细胞进行。

1.4 总RNA提取及实时定量聚合酶链反应检测Cyr61的表达

按照Trizol试剂说明书提取正常成纤维细胞和增生性成纤维细胞总RNA，用DEPC处理过的蒸馏水溶解。采用德国EPPENDORF公司分光光度计检测RNA溶液A260/A280吸光度，计算RNA浓度和纯度，A260/A280比值>1.8方可用于检测，1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。依据real-time PCR试剂盒说明书，逆转录合成 cDNA模板，进行目的基因的 PCR扩增， 产物经8%聚丙酰胺凝胶电泳分析。所有反应均设立3复孔，记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数即Ct值。以GAPDH作为内参照，采用定量PCR中的相对定量法，以2-ΔCt表示目的基因相对于内参的相对表达量，其中ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH。荧光定量PCR的反应体系与条件： 95℃ 预变性10 min ， 1 个循环， 95℃、变性 30 s ， 退火 40 s，72 ℃延伸 40 s ， 共 45 個循环。本实验应用到的引物：Cyr61 正向 5CTCCCTGTTTTTGGAATGGA3，负向5TGGTCTTGCTGCATTTCTTG3；GAPDH 正向5GAGTCAACGGATTTGGTCGT3，负向5TTGATTTTGGAGGGATCT CG3。endprint

1.5 細胞免疫化学检测Cyr61蛋白的表达

正常皮肤细胞及增生性瘢痕细胞种植于放有盖玻片的6孔板，用4%的多聚甲醛于室温固定10 min，用PBS冲洗三次，在常温利用0.2%Triton X-100透化5 min。冲洗后用5%的BSA封闭30 min，1：50的兔抗人Cyr61抗体孵育过夜。清洗后，用1：50稀释的结合FITC的山羊抗兔抗体避光常温孵育1 h。用PBS清洗后，将盖玻片取出，置于滴有缓冲甘油的载玻片上，用激光共聚焦显微镜（OLYMPUS）观察，发射光波长495 nm，激发光波长488 nm。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞中Cyr61的mRNA检测

为检测Cyr61的mRNA表达水平，我们利用实时PCR分析。本实验增生性瘢痕Cyr61mRNA的表达高于正常皮肤（P<0.05），见封三图1。

2.2 增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞中Cyr61的检测

Cyr61在胞质表达后与一抗、二抗结合，在蓝光激发下发射出绿光，在显微镜下显示成绿色，绿光强度越高代表细胞中Cyr61的含量也多，每一盖玻片任意取6个视野拍照，再运用IMAGE-PRO PLUS软件对图像进行分析，计算出绿光的平均光强度，比较两种细胞中Cyr61的表达差异。增生性瘢痕成纤维细胞Cyr61表达量明显高于正常皮肤成纤维细胞（P<0.05），见封三图2～6。

3 讨论

增生性瘢痕的形成包括遗传、炎症、免疫、细胞因子等多种因素。增生性瘢痕的特点是在皮肤创伤愈合后仍持续发生的真皮纤维结缔组织增生，组织学上以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质过度沉积、成纤维细胞过度增生为特点[5-7]。对成纤维细胞的增殖进行干预，调控胶原的合成，加速胶原的降解，进而治疗胶原紊乱引起的各类纤维化疾病在理论上是可行的，在临床中也取得了一定的疗效。

目前的研究发现Cyr61参与多种病理生理过程，具有明显的促有丝分裂活性和趋化性，可诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质，并参与调解细胞增生、分化、胚胎发育形成[8，9]。成人Cyr61的表达与组织的炎症及创伤修复是相关的，在皮肤创面愈合过程中，其与TGF-β在创伤修复中所介导的通路可以是相互叠加，相互抵抗，相互协助的。作为细胞外基质结合信号蛋白，Cyr61与整合素受体结合介导粘附信号、细胞迁移及增强生长因子诱导的有丝分裂。它不仅在血管内皮细胞中通过直接结合整合素αvβ3诱导血管生成，而且在肌成纤维细胞增殖并合成细胞外基质以保持组织的完整性以及帮助提供抗菌的屏障，它们甚至能合成α-肌动蛋白促进创口挛缩加速创口愈合[10-12]，Cyr61在这一时期的肌成纤维细胞中表达明显增高，当 Cyr61积累达到相当高的水平时表现为促进肌成纤维细胞衰老[13，14]，在创面愈合后期这一促衰老的过程表现为对细胞外基质合成及沉积的自我限制[15， 16]，以避免细胞外基质的过度合成沉积所致的过度纤维化，瘢痕化及功能丧失。

本实验中，Cyr61 mRAN及Cyr61蛋白在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达均明显高于正常皮肤成纤维细胞。创面的损伤以及修复过程中，细胞外基质分泌沉积及塑形，创面在肌成纤维细胞的作用下开始挛缩，此时创面新生的肉芽组织成纤维细胞中的Cyr61就会明显增高[17]。而创面修复完成后，成纤维细胞增殖过度，肉芽组织就会转化为瘢痕组织，该瘢痕组织中Cyr61的高表达，表明其在增加细胞外基质分泌及促进瘢痕形成中起到一定作用。有学者研究证实Cyr61参与成纤维细胞的增殖以及细胞外基质的沉积是通过结合细胞膜上的整合素αvβ3，故在瘢痕的形成过程中，Cyr61可能通过相同的细胞内信号通路促使成纤维细胞增殖从而导致细胞外基质的分泌与沉积[12，18，19]。Cyr61在皮肤创伤修复的肉芽组织中表达明显增高，且Cyr6通过结合成纤维细胞粘附受体（整合素α6β1及细胞表面的肝磷脂蛋白聚糖），依赖p-53及p16INK4a介导衰老的信号途径诱导成纤维细胞衰老，在创面愈合后期该过程则表现为对细胞外基质分泌及沉积的自我限制，以避免细胞外基质的过度沉积所致的纤维化、瘢痕化及功能丧失。

有学者认为[20]Cyr61在胶原的合成和降解中起着关键作用，其在成纤维细胞中能使胶原Ⅰ的减少而金属蛋白酶Ⅰ表达增多。我们的结果显示，Cyr61在增生性瘢痕的表达较正常皮肤中减少，考虑其具有降解胶原的作用，而增生性瘢痕是胶原过度沉积所致，故我们推测可能是Cyr61下游通路某种因子缺失或无表达所致的一种负反馈。在本次试验并未对Cyr61的下游信号通路受体进行检测，对该解释仍需进一步进行试验研究。

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（收稿日期：2017-08-08）endprint