常佩芬，唐蓓蕾，郭 宁，赵红霞，赵 勇，高永红，朱海燕△

(1. 北京中医药大学东直门医院心血管内科，北京 100700； 2. 北京中医药大学心血管病研究所，北京 100700； 3. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 4. 国家中医药管理局心脉病证益气活血重点研究室，北京 100700； 5. 北京中医药大学中西医结合气血研究实验室，北京 100700)

【实验研究】

清开灵注射液对老年痴呆小鼠血液、脑组织Aβ含量及神经递质的影响❋

常佩芬1,2，唐蓓蕾1，郭 宁1，赵红霞3，赵 勇1,2，高永红4,5，朱海燕1,2△

(1. 北京中医药大学东直门医院心血管内科，北京 100700； 2. 北京中医药大学心血管病研究所，北京 100700； 3. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 4. 国家中医药管理局心脉病证益气活血重点研究室，北京 100700； 5. 北京中医药大学中西医结合气血研究实验室，北京 100700)

目的：观察清开灵注射液对老年痴呆小鼠血液和脑组织中β-淀粉样蛋白(Aβ)含量以及神经递质乙酰胆碱(Ach)、一氧化氮(NO)水平的影响，探讨清开灵防治老年痴呆的部分作用机制。方法：采用转基因快速老化痴呆小鼠Sam P8模型，按随机数字表法分为模型组、清开灵注射液组、阳性药对照组，以正常老化小鼠Sam R1为正常对照组。实验组小鼠腹腔注射清开灵注射液1个月后比较各组血清及脑组织中Aβ水平，并检测脑组织中Ach、NO含量。结果：清开灵可明显降低痴呆小鼠血液中Aβ含量，增加脑内神经递质Ach、NO水平。结论：清开灵注射液改善老年痴呆的作用可能与清除血液中Aβ、增加神经递质Ach、NO水平有关。

清开灵注射液；老年痴呆；β-淀粉样蛋白；神经递质

虽然阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)的病因及发病机制尚不完全明确，但淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)在其病理发生发展过程中占据中心地位已是不争的事实。新近的研究提示，AD患者脑中可溶性Aβ可能主要来源于血液[1-2]，可溶性Aβ通过病理状态下的血脑屏障，在脑内聚集形成有毒物质对神经元造成损伤，同时影响正常神经递质的产生及代谢，最终导致疾病发生。本研究小组前期实验证实，清开灵注射液能明显改善老化痴呆小鼠的学习记忆能力[3]。为此，本实验采用转基因老化痴呆小鼠模型，通过检测小鼠血液及脑组织中Aβ含量和脑实质中神经递质活性，探究AD的可能发病机制，并观察清开灵注射液的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2月龄快速老化痴呆雄性小鼠Sam P854只，2月龄正常老化痴呆雄性小鼠Sam R118只(北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 SCXK(京)2012-0001)。

1.2 药物及试剂

清开灵注射液(河北神威药业有限公司，批号13052061)、安理申片(卫材(中国)药业有限公司，批号130330 A)、小鼠β淀粉样蛋白1-40酶联免疫检测试剂盒(AMEKO，货号AE91032Mu)、乙酰胆碱(Ach)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A105-1)、一氧化氮(NO)测试盒(南京建成生物工程研究所，货号A013-2)。

1.3 仪器设备

电热恒温水浴锅(中国泰斯特，型号HH.W21.420)、全自动酶标仪(Thermo公司，型号MK3)、Olympus BX60型显微镜和SPOT-Ⅱ(Diagnostic Instrumens.Inc)图像采集软件。

1.4 动物分组及给药

1.4.1 分组 快速老化痴呆雄性小鼠Sam P854只，按随机数字表法分为模型组、清开灵组、安理申(阳性药)组，正常老化雄性小鼠Sam R1为对照组，每组18只。

1.4.2 给药 清开灵注射液用生理盐水稀释成20%的注射液，安理申用纯净水配置成0.07 mg/ml的溶液。清开灵组按3 ml/kg腹腔注射20%的清开灵稀释液，同时按100 ml/kg灌服纯净水；安理申组按15 ml/kg腹腔注射生理盐水，同时按0.7 mg/kg灌服安理申；模型组和对照组腹腔注射相同比例的生理盐水并灌服纯净水，每周连续给药5 d共4周。

1.5 血液及脑组织中Aβ含量的测定

实验结束后每组各取6只小鼠采用摘眼球取血，冰盘上剥离取全脑弃嗅球及小脑。离心取血清，脑组织用冰生理盐水冲洗，滤纸吸干水分制成10%脑组织匀浆。按说明书采用酶联免疫吸附法测定各组标本Aβ含量。

1.6 脑组织Ach活性和NO含量测定

每组各取6只小鼠断头处死，冰盘上剥离取全脑弃去嗅球及小脑，称重后加入预冷的生理盐水，制成10%脑组织匀浆，严格按试剂盒要求操作。

1.7 光镜下海马CA1区的组织结构变化

每组各取6只小鼠用4%多聚甲醛灌注后取脑，脑组织于4%多聚甲醛固定液固定24 h，经梯度酒精脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，行冠状切片(5 μm)裱于多聚赖氨酸防脱玻片上，避光阴凉处保存。采用伊红-苏木素染色法，光镜下观察海马区脑组织。

2 统计学方法

3 结果

3.1 清开灵注射液对痴呆小鼠血液及脑组织中Aβ含量的影响

表1显示，模型组血液及脑组织中Aβ含量较对照组明显增加，清开灵注射液可显著降低血液中Aβ的含量，但对脑组织中Aβ含量的影响相对较小，虽有减少趋势但差异无统计学意义。

3.2 清开灵注射液对痴呆小鼠脑组织中Ach活性及NO水平的影响

表1显示，模型组小鼠Ach活性及NO水平均较对照组明显减少，清开灵注射液可显著提高痴呆小鼠脑组织中Ach活性，增加NO水平。

表1 清开灵注射液对痴呆小鼠血液及脑组织中Aβ及神经递质水平的影响

注：与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01

图1 清开灵注射液对痴呆小鼠海马CA1区脑组织结构的影响(×40)

3.3 清开灵注射液对痴呆小鼠海马CA1区脑组织结构的影响

图1显示，观察小鼠海马CA1 区可见，正常组神经元结构完整，细胞排列整齐，形态正常，分布均匀；模型组大量神经元变性坏死，细胞体积缩小，胞核固缩，染色加深，形状不规则伴有明显的嗜神经现象；清开灵组及安理申组部分神经细胞坏死，形状不规则，核固缩，染色加深，与模型组比较神经元损伤情况明显减轻。

4 讨论

β淀粉样蛋白在AD的病理发生发展过程中占据中心地位，Aβ如何在大脑中聚集增多是AD研究中的关键环节。早期研究认为，AD的发生是由于脑内相关基因突变导致淀粉样蛋白前体(APP)过度表达或加工异常，致使毒性Aβ产生增加。近期的研究发现，脑中可溶性Aβ可能主要并长期来源于血液[1-2]。在典型的老年痴呆病理过程中，大脑并没有Aβ产生增加的证据，而更像是Aβ清除能力相对不足[4]。此外，老年痴呆患者的血浆Aβ浓度在易感年龄的某一时期可明显增加，随后又回落至正常[5]，因此提出老年痴呆Aβ的血液起源理论[6]。

在前期清开灵注射液干预快速老化痴呆小鼠的研究中发现，清开灵注射液能够明显改善老化痴呆小鼠的学习记忆能力[3]。安理申是当前治疗轻中度老年痴呆症的首选药，在改善老年痴呆症的认知功能、学习能力及记忆力方面均有明确疗效，因此作为此次实验的阳性对照药。

本实验采用转基因老年痴呆小鼠作为模型组，通过酶联免疫检测发现，模型小鼠血液及脑组织中Aβ的含量确实较正常小鼠明显增加。同时发现，模型小鼠脑组织中Ach及NO浓度显著减少，其2种神经递质在一定浓度范围内与大脑学习记忆能力呈正相关[7]。

通络治疗是王永炎院士“浊毒损伤脑络”病机理论的核心体现[8]。老年人脏腑功能渐虚，气血运行失常，生痰生瘀，聚积成浊毒，瘀阻脑络，神机失用。在AD患者脑内异常聚集的Aβ也可视作内毒聚集的一种表现。清开灵注射液具有清热解毒、镇静安神之功效。采用清开灵注射液干预痴呆小鼠，光镜下发现该药能够明显改善小鼠海马CA1 区神经元结构，减少神经细胞的变性坏死，清除AD患者血液中过多的Aβ，增加脑内学习与记忆相关神经递质Ach及NO含量。本次实验并未发现清开灵注射液能够减少脑内Aβ水平，但有这种趋势。这可能与动物样本量较少有关，有待进一步验证。本研究结果为“解毒通络”治法的扩展应用提供了初步实验依据，并进一步开拓了AD治疗的新思路。

[1] CLIFFORD PM, ZARRABI S, SIU G, et al. Abeta peptides can enter the brain through a defective blood-brain barrier and bind selectively to neurons [J]. Brain Res,2007，1142(1):223-236.

[2] BELL RD, ZLOKOVIC BV. Neurovascular mechanisms and blood-brain barrier disorder in Alzheimer's disease [J]. Acta Neuropathol， 2009,118(1):103-113.

[3] 邱蕾,郑璐,张瑶,等.清开灵对快速老化痴呆小鼠学习记忆能力的影响及作用机制研究[J].中国中西医结合杂志, 2010,30(7):738-742.

[4] ZLOKOVIC BV. Clearing amyloid through the blood-brain barrier [J]. J Neurochem， 2004,89(4):807-811.

[5] ZLOKOVIC BV. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders [J]. Neuron， 2008,24,57(2):178-201.

[6] ROY S, RAUK A. Alzheimer’s disease and the ‘ABSENT’ hypothesis: mechanism for amyloid beta endothelial and neuronal toxicity [J]. Med Hypotheses， 2005,65(1):123-137.

[7] GENTILONI SILVERI N, MAZZONE M, PORTALE G, CARBONE L. A general review about the different roles of this innocent radical [J]. Minerva Med， 2001，92(3):167-171.

[8] 李卫红, 青雪梅. 从络论治脑病的中药研发思维探索 [J]. 北京中医药大学学报, 2006, 29(5):304-306.

EffectofQingkailingInjectiononAβcontentandNeurotransmitterinBloodandBrainTissueofSenileDementiaMice

CHANG Pei-fen1,2, TANG Bei-lei1, GUO Ning1, ZHAO Hong-xia3, ZHAO Yong1,2, GAO Yong-hong4,5, ZHU Hai-yan1,2△

(1.CardiovascularmedicineofDongzhimenHospital,BUCM,Beijing100700,China; 2.InstituteofCardiovascularDisease,BUCMBeijing100700,China; 3.InstituteofBasicTheoryforChineseMedicine，ChinaAcademyofChineseMedicineScience,Beijing100700,China; 4.KeyLaboratoryofQi-tonifyingandBlood-activatingTherapeuticRulesforCardiovascularDiseases,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,Beijing100700,China; 5.KeyLaboratoryofChineseInternalMedicine,MinistryofEducation,Beijing100700,China)

Objective:To detect the role of Qingkailing injection on expression of β-amyloid protein(Aβ)、racetylcholine(Ach) and nitric oxide(NO) respectively in mice’s brain and blood.The purpose was to explore the sectional mechanism that Qingkailing injection in the prophylaxis and treatment of Alzheimer’s disease(AD).Methods:Used senescence accelerated mice prone 8(Sam P8)as experiment models,54 transgenic mice were randomly divided into a model group,a therapy group(Qingkailing injection),a positive drug group(Aricept),according to the random number table method.And used Sam R1 as the control group. Therapy group were intraperitoneal injection of Qingkailing injection.The course of treatment of each group was a month.Compared the expression of Aβ in serum and brain tissue,and detected the level of Ach and NO in brain tissue.Results:Qingkailing injection can significantly reduce the expression of Aβ of dementia mice in serum,and increase the levels of Ach and NO in brain tissue.Conclusion:The mechanism of Qingkailing injection improve Alzheimer’s disease is likely related to it clear the Aβ in serum,and increase Ach and NO.

Qingkailing injection; Dementia; β-amyloid protein; Neurotransmitter

国家自然科学基金资助项目(81202686)-解毒通络法抑制AD血脑屏障转运Aβ的机制研究

常佩芬(1972-),女，北京人，副主任医师，医学博士，从事中医药防治心脑血管疾病的临床与基础应用。

△通讯作者：朱海燕，Tel:010-84013141， E-mail:zhuhaiyangy@163.com。

R285.5

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1006-3250(2017)11-1552-02

2017-03-18